The effect of ozone therapy on the antioxidant protection enzymes of cattle with Mortellaro disease

Full Text

Введение. Основной причиной преждевременной выбраковки животных из стада являются инфекционные поражения дистальных отделов конечностей, в частности болезнь Мортелларо, поражающая до 60 % крупного рогатого скота в России и часто переходит в хроническую форму [1]. Возбудитель болезни Мортелларо окончательно не идентифицирован, однако ведущая роль отводится спирохетоподобным бактериям рода Treponema (в частности, Treponema medium, Treponema phagedenis, Treponema pedis). Дополнительно в патологическом процессе могут участвовать другие микроорганизмы: Fusobacterium necrophorum, Dichelobacter nodosus, Prevotella spp [2, 3, 4].

Факторами, способствующими развитию болезни являются высокая влажность и антисанитария в помещениях, механические повреждения кожи копыт, нарушение кератогенеза и гигиены копыт, ослабленный иммунитет животных [5].

Через микротравмы кожи в области межкопытной щели и венчика в глубокие слои дермы проникает возбудитель рода Treponema. Ключевым признаком является разрушение кератинового слоя, вероятно, вследствие действия бактериальных кератолитических токсинов. Бактерии колонизируют эпидермис, вызывая воспаление и изъязвление. В ответ на это активируются защитные системы организма, инфильтрация нейтрофилами, образование грануляционной ткани. Бактерии Treponema легко распространяются в навозе [6, 7].

Инфекционные поражения копыт, сопровождаются воспалением и активацией свободнорадикальных процессов, что приводит к окислительному стрессу. Антиоксидантная система (АС) включает ферментативные и неферментативные компоненты, которые нейтрализуют свободные радикалы и предотвращают повреждение клеток [8]. Таким образом, при развитии болезни Мортелларо у крупного рогатого скота наблюдается сложная динамика активности ферментов пероксидазной системы, тесно связанная с патогенезом заболевания. Имея представление о динамике изменения ферментов антиоксидантной защиты мы можем судить как об интенсивности патологического процесса, так и об эффективности его лечения [9].

Традиционное лечение включает системное применение антибиотиков (окситетрациклин и др.), однако широкое распространение резистентности у трепонем диктует необходимость поиска альтернативных или дополнительных методов [2]. Озонотерапия обладает антимикробным, иммуномодулирующим и регенераторным действием, что делает её перспективной в комплексном лечении пальцевого дерматита [3, 10]. Озон, проникая в ткани, распадается с образованием активных форм кислорода, которые повреждают мембраны бактерий, снижают продукцию супероксида нейтрофилами (ингибирование NADPH-оксидазы) и активируют эндогенные антиоксидантные системы [10, 11].

Цель исследований – оценить влияние местной озонотерапии на активность ферментов антиоксидантной защиты у коров с болезнью Мортелларо на фоне стандартной антибиотикотерапии.

Задачи исследований. Определить основные изменения в антиоксидантной системе коров при болезни Мортелларо, установить возможность ускорения восстановления показателей антиоксидантной защиты при применение озоновых ванн (концентрация озона 60 мг/м³, экспозицией в 13 минут ежедневно в течение 5 дней) в комплексе с системной антибиотикотерапией.

Материалы и методы исследований. Изучение клинических проявлений поражений кожи и кожных покровов дистальных отделов конечностей при Болезни Мортелларо проводилось непосредственно в условиях фермерского хозяйства ООО «Колхоз-Племзавод Имени Чапаева» Ставропольский Край, р-н Кочубеевский. Все исследования проводились в соответствии с Этическими нормами и Федеральным законом от 27 декабря 2018 года №498-ФЗ «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации».

В качестве объекта исследования были подобраны коровы голштино-фризской породы с подозрением на болезнь Мортелларо разного возраста 2-5 лет.

Животные содержались в отдельных стойлах, размером 1,2×1,8 м, система содержания беспривязно-боксовое. Суточный рацион всех животных был сбалансирован.

Исследование проводилось в два этапа. На первом этапе изучали динамику показателей антиоксидантной системы при естественном течении болезни Мортелларо. Для этого были сформированы группа здоровых животных (n=10) и группа больных коров (n=10), которым не проводили этиотропное лечение в течение 14 суток (впоследствии все животные получили необходимое лечение). У животных этой группы кровь отбирали на 1‑е, 4‑е и 14‑е сутки от момента постановки диагноза. Полученные данные представлены в таблице 1.

На втором этапе оценивали эффективность разных схем лечения. Для этого были отобраны 20 коров с клиническими признаками болезни Мортелларо, которых методом случайной выборки разделили на две равные группы (n=10). Животным обеих групп внутримышечно вводили окситетрациклин в дозе 20 мг/кг один раз в сутки в течение 5 дней, проводили санацию копыт и местное применение тетрациклиновой мази. Группа 1 (контрольная) получала только указанную терапию. Группа 2 (опытная) дополнительно ежедневно в течение 5 дней подвергалась местной обработке поражённых копыт озоновоздушной смесью в разработанном нами лечебно-профилактическом комплексе (пат. RU 2791801). Концентрация озона в газовой фазе контролировали с помощью датчика
OZ-3 (Hengko, Китай) и составляла 60 мг/м³, экспозиция – 13 минут. Кровь для биохимических исследований отбирали у всех животных второй фазы до начала лечения (1‑е сутки), на 4‑е и 14‑е сутки от начала терапии. Результаты представлены в таблицах 2-4.

В сыворотке крови определяли: активность каталазы (КФ 1.11.1.6) – по реакции разложения H₂O₂ с образованием окрашенного комплекса с молибдатом аммония; активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) – по скорости окисления бензидина в присутствии H₂O₂; уровень восстановленного глутатиона – методом Эллмана; активность глутатионпероксидазы (GPx, КФ 1.11.1.9) – по убыли ее в реакции с H₂O₂; содержание диеновых конъюгатов (маркер перекисного окисления липидов) – спектрофотометрически.

Результаты исследований. При общем осмотре: животные лежали, вставали с трудом и неохотно, проявляли нежелание двигаться, испытывали боль при попытке опереться на больную конечность. На внутренней поверхности подошвы, на месте разделения копытец, на стыке кожи и рога имелась четко очерченная язва с ярко-красной грануляцией, визуально определялась выраженная отечность в области венчика, фиксировали местное повышение температуры, пальпация подошвы вызывала болезненную реакцию. Воспаленный участок имел мелкозернистую красную поверхность, был болезненным на ощупь и источал неприятный запах. Диаметр пораженных участков варьировался от 6 миллиметров до 8,5 сантиметров.

Для оценки влияния самого заболевания на антиоксидантную систему у 10 больных коров (до лечения) исследовали динамику ферментов в сопоставлении с группой здоровых животных (табл. 1).

 

Таблица 1

Влияние Болезни Мортелларо на антиоксидантную систему коров

Показатель	Здоровые (n=10)	1 сутки (n=10)	4 сутки (n=10) (пик заболевания)	14 сутки (n=10) (Хроническая стадия)
Активность каталазы (мкМ H₂O₂/л·мин·10³)	22,4 ± 2,3	18,7 ± 2,1	12,5 ± 1,8	9,2 ± 1,3
Активность пероксидазы (ед. опт. пл./л·сек)	1,65 ± 0,18	2,30 ± 0,3	3,45 ± 0,4	1,20 ± 0,15
Глутатион восстановленный (GSH) (ммоль/л)	5,2 ± 0,6	4,6 ± 0,5	2,8 ± 0,4	1,9 ± 0,3

 

При наблюдении за животными, не получавшими специфического лечения в течении 14 суток (табл. 1), установлено, что на 1‑е сутки заболевания активность каталазы была снижена на 16 % по сравнению со здоровыми коровами, уровень восстановленного глутатиона – на 12 %, а активность пероксидазы повышена на 39 %. К 4‑м суткам (пик воспаления) отмечено максимальное угнетение антиоксидантной защиты: каталаза снизилась на 44 %, глутатион восстановленный – на 46 %, пероксидаза возросла на 109 % относительно нормы. На 14‑е сутки (переход в хроническую форму) зафиксировано дальнейшее истощение системы: активность каталазы составляла лишь 41 % от нормы, восстановленный глутатион – 36 %, а пероксидаза упала ниже нормы (на 27 %), что свидетельствует о декомпенсации.

Оценка эффективности лечения. До начала лечения (1‑е сутки) показатели антиоксидантной системы у животных групп 1 и 2 достоверно не различались (табл. 2), что подтверждает корректность рандомизации. У всех больных коров активность каталазы была снижена на 54-55 % от уровня здоровых животных, глутатион восстановленный – на 51-52 %, пероксидаза повышена на 93-94 %.

 

Таблица 2

Показатели антиоксидантной системы в группах больных коров до лечения (1-е сутки)

Показатель	Здоровые (n=10)	Группа 1 (антибиотик, n=10)	Группа 2 (антибиотик+озон, n=10)
Активность каталазы (мкМ H₂O₂/л·мин·10³)	22,4 ± 2,3	11,2 ± 1,3	11,5 ± 1,4
Активность пероксидазы (ед. опт. пл./л·сек)	1,65 ± 0,18	3,2 ± 0,4	3,1 ± 0,3
Глутатион (GSH) восстановленный (ммоль/л)	5,2 ± 0,6	2,5 ± 0,3	2,6 ± 0,3

 

На 4‑е сутки терапии (табл. 3) в группе 2 (с озонотерапией) наблюдалось более выраженное улучшение антиоксидантного статуса. Активность каталазы в группе 2 превышала показатель группы 1 на 30 %, уровень GSH – на 40 %, активность пероксидазы была ниже на 32 %. Содержание диеновых конъюгатов в группе 2 оказалось в 1,6 раза ниже, чем в группе 1, что указывает на меньшую интенсивность перекисного окисления липидов.

 

Таблица 3

Показатели антиоксидантной системы в группах на 4-е сутки лечения

Показатель	Здоровые (n=10)	Группа 1 (антибиотик, n=10)	Группа 2 (антибиотик+озон, n=10)
Активность каталазы (мкМ H₂O₂/л·мин·10³)	22,4 ± 2,3	14,2 ± 1,6	18,5 ± 1,9
Активность пероксидазы (ед. опт. пл./л·сек)	1,65 ± 0,18	2,80 ± 0,30	1,90 ± 0,20
Активность глутатионпероксидазы (GPx) (мкМ GSH/л·мин·10³)	45,2 ± 4,8	28,5 ± 3,2	36,8 ± 4,0
Глутатион (GSH) восстановленный (ммоль/л)	5,2 ± 0,6	3,0 ± 0,4	4,2 ± 0,5
Диеновые конъюгаты (ед. опт. пл./мг липидов)	1,5 ± 0,2	3,5 ± 0,5	2,2 ± 0,3

 

К 14‑м суткам (табл. 4) в группе 2 большинство показателей приблизились к значениям здоровых животных, тогда как в группе 1 сохранялись достоверные отклонения. Активность каталазы в группе 2 составила 94 % от нормы, уровень восстановленного глутатиона – 92 %; пероксидаза и диеновые конъюгаты не отличались от нормы. В группе 1 эти показатели оставались изменёнными (каталаза – 75 % от нормы, глутатион восстановленный – 67 %, пероксидаза и диеновые конъюгаты – повышенными).

 

Таблица 4

Показатели антиоксидантной системы в группах на 14-е сутки лечения

Показатели антиоксидантной системы в группах на 14-е сутки лечения	Здоровые (n=10)	Группа 1 (антибиотик, n=10)	Группа 2 (антибиотик+озон, n=10)
Активность каталазы (мкМ H₂O₂/л·мин·10³)	22,4 ± 2,3	16,8 ± 1,8	21,0 ± 2.2
Активность пероксидазы (ед. опт. пл./л·сек)	1,65 ± 0,18	2,20 ± 0,25	1,70 ± 0,18
Активность глутатионпероксидазы (GPx) (мкМ GSH/л·мин·10³)	45,2 ± 4,8	32,0 ± 3,5	42,5 ± 4,5
Глутатион (GSH) восстановленный (ммоль/л)	5,2 ± 0,6	3,5 ± 0,5	4,8 ± 0,6
Диеновые конъюгаты (ед. опт. пл./мг липидов)	1,5 ± 0,2	2,8 ± 0,4	1,6± 0,2

 

Проведённое нами исследование подтвердило, что болезнь Мортелларо (пальцевый дерматит) у крупного рогатого скота сопровождается глубокими нарушениями в системе антиоксидантной защиты. Полученные данные о снижении активности каталазы и уровня восстановленного глутатиона на фоне повышения активности пероксидазы и накопления диеновых конъюгатов согласуются с современными представлениями о роли окислительного стресса в патогенезе инфекционных поражений копыт.

Как отмечают в своём обзоре Корюкина М. В. (2024), болезнь Мортелларо представляет собой мультифакториальную патологию, при которой хроническое воспаление и бактериальная инвазия запускают каскад свободнорадикальных реакций. Наши результаты наглядно демонстрируют эту динамику. Определенное нами повышение активности пероксидазы на 4-е сутки (табл. 1), вероятно, связано с активацией нейтрофилов в очаге воспаления. Как показали Tunç A. S. с соавторами (2021), при патоморфологическом исследовании тканей при пальцевом дерматите наблюдается массивная нейтрофильная инфильтрация, которая и является источником избыточной продукции активных форм кислорода.

Снижение активности каталазы и глутатиона, зафиксированное нами на 14-е сутки, указывает на срыв адаптационных механизмов. Это соответствует данным Sayiner S. с соавторами (2021), которые показали, что при длительных патологических процессах у коров ресурсы антиоксидантной системы истощаются, и развивается декомпенсация.

Переходя к оценке терапевтических подходов, следует отметить, что традиционная антибиотикотерапия, применявшаяся в группе 1, хотя и приводила к некоторому улучшению показателей к 14-му дню, не обеспечивала полного восстановления антиоксидантного статуса. Это косвенно подтверждает проблему формирования резистентности у трепонем, описанную в зарубежных исследованиях Thomas A.D. с соавторами (2022) и Brodard I. с соавторами (2021), которые указывают на сложность культивирования и идентификации штаммов Treponema spp., устойчивых к стандартным схемам терапии. Кроме того, как подчёркивают Afonso J.S. с соавторами (2021), диагностика и контроль эффективности лечения требуют комплексного подхода, включающего не только клинические, но и биохимические маркеры.

Основным преимуществом применения озоно-воздушных ванн при лечении Мортелларо от существующих аналогов является газообразное состояние активного компонента. Озон, за счет мелкоразмерных частиц способен проникать в любые участки воспаления и как следствие убивать патогенные микроорганизмы. Озон влияет на антиоксидантную систему, предотвращая развитие свободных радикалов и активируя выработку глутатиона. Таким образом повышается эффективность лечения болезни Мортелларо.Включение местной озонотерапии в комплекс лечебных мероприятий (группа 2) привело к принципиально иным результатам. Уже к 4-м суткам мы наблюдали достоверно более высокую активность каталазы и глутатионпероксидазы, а также более низкий уровень пероксидазы и диеновых конъюгатов по сравнению с контролем. К 14-м суткам показатели опытной группы практически не отличались от таковых у здоровых животных. Наши данные совпадают с мнением Беламбри С.А. с соавторами (2018) и Йомовой К. с соавторами (2024).

Кроме того, озон, вероятно, стимулирует эндогенный синтез глутатиона. Именно этим может объясняться более быстрое восстановление пула глутатиона в опытной группе нашего исследования. С такой трактовкой согласны Filho MLES с соавторами (2024), Луцкий М.А. с соавторами (2014).

Включение озоновых ванн, как показано в нашем исследовании, не только купирует окислительный стресс, но и, вероятно, создаёт условия для более быстрой репарации тканей за счёт нормализации микроциркуляции и местного иммунитета, о чём писали Осиков М.В. с соавторами (2023) в своих доклинических исследованиях.

Наши данные дополняют исследования Паторова Д.А. с соавторами (2022) и Челноковой М.И. (2020), показывая, что озонирование может быть эффективным компонентом не только лечебных, но и профилактических мероприятий, поскольку здоровый антиоксидантный статус повышает устойчивость тканей.

Интересно сопоставить наши результаты с более ранним исследованием Scrollavezza P. et al. (2002), которые применяли озонированную аутогемотерапию при лечении межпальцевых флегмон у коров и отметили высокую эффективность метода, сравнимую с антибиотиками. В нашем исследовании использован другой метод доставки озона (местные газовые ванны), что технически проще для массового применения в условиях фермы, и полученные данные подтверждают, что локальная обработка также способна оказывать системное антиоксидантное действие, нормализуя показатели крови.

Заключение. Болезнь Мортелларо у коров голштино-фризской породы характеризуется развитием окислительного стресса, проявляющегося снижением активности каталазы и уровня восстановленного глутатиона, повышением активности пероксидазы и накоплением диеновых конъюгатов. Наибольшие изменения наблюдаются на 4-е сутки заболевания (пик воспаления), а при хронизации (14-е сутки) наступает истощение антиоксидантной системы.

Местное применение озоновых ванн (концентрация озона 60 мг/м³, экспозиция 13 минут ежедневно в течение 5 дней) в комплексе с системной антибиотикотерапией (окситетрациклин) достоверно ускоряет восстановление показателей антиоксидантной защиты по сравнению с монотерапией антибиотиком. К 14-м суткам лечения у животных опытной группы активность каталазы, пероксидазы, глутатионпероксидазы, уровень GSH и диеновых конъюгатов не отличались от значений здоровых коров.

Динамика ферментов антиоксидантной системы может служить дополнительным критерием оценки тяжести патологического процесса и эффективности лечения при болезни Мортелларо.

Полученные данные обосновывают целесообразность включения озонотерапии в комплексные схемы лечения пальцевого дерматита у крупного рогатого скота.

About the authors

Nikolay A. Gvozdetsky

Stavropol State Agrarian University

Email: nikolay140890@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6856-4932

PhD, Senior Lecturer, Department of Epizootology and Microbiology

Russian Federation, Stavropol

Ekaterina Yu. Ragulina

Stavropol State Agrarian University

Email: cnufe@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-1066-7187

3nd year Postgraduate Student of the Department of Therapy and Pharmacology

Russian Federation, Stavropol

Valery A. Belyaev

Stavropol State Agrarian University

Author for correspondence.
Email: valstavvet@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7454-8472

Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Department of Therapy and Pharmacology

Russian Federation, Stavropol

Aksinya I. Dudenko

Stavropol State Agrarian University

Email: aksinya.dudenko@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-6883-4186

2nd year student at the Institute of Veterinary and Biotechnology

Russian Federation, Stavropol

References

Supplementary files