Pharmaco-toxicological assessment of the effect of the rachipred supplement on morphofunctional blood parameters in laboratory rats

Full Text

У сельскохозяйственных животных в животноводческих предприятиях патологии минерального обмена, такие как остеодистрофия у взрослого поголовья и рахит у молодняка, можно считать самыми многочисленными незаразными патологиями [1, 2]. Несмотря на это, проблема не создаёт беспокойства среди практикующих специалистов, так как не образует внезапных чрезвычайных ситуаций, как в случае возникновения инфекционных болезней [3].

Высокая концентрация поголовья молодняка на ограниченных площадях под постоянным влиянием большого количества разнообразных стресс-факторов обусловливает нарушения обмена веществ, в том числе минерального, что приводит к развитию клинического рахита. Преимущественное расстройство как D-витаминного, так и фосфорно-кальциевого обмена веществ отражается почти на всех жизненных функциях растущего организма [4]. Вследствие нарушения минерального обмена происходит снижение интенсивности развития и набора массы тела у растущего молодняка, снижение продуктивных показателей у молочных коров [5].

Рахит у молодняка и остеодистрофия у взрослых животных в первую очередь проявляются как нарушение морфологического и структурного состава костей скелета, но также страдают и другие функциональные системы организма: сердечно-сосудистая, нервная, дыхательная, пищеварительная, система крови и др. Наиболее частые изменения характеризуются развитием алиментарной анемии, снижением адаптационных и резистентных свойств организма, нарушением параметров телосложения и развитием кахексии. Наличие системных нарушений неминуемо приводит к ослаблению организма и созданию необходимой почвы для развития факторной патологии. У взрослых животных это чаще всего выражается в виде акушерско-гинекологических заболеваний, а у молодняка – инфекционно-воспалительных заболеваний органов дыхания и пищеварения [5, 6].

Наиболее значимые физико-химические процессы в организме реализуются при участии минеральных макро- и микроэлементов. Несмотря на наличие в рационе питательных составляющих и воды, при отсутствии минеральных компонентов развиваются процессы, приводящие к угнетению жизнедеятельности, кахексии, а впоследствии и к гибели животного. Дефицит отдельных макро- и микроэлементов приводит к снижению продуктивных качеств животных, возникновению секундарных заболеваний, к сдерживанию развития и роста у молодых животных [7]. Минеральные вещества являются структурно-функциональными компонентами ферментов, витаминов и гормонов, обуславливая энергетический, азотный, углеводный и липидный обмен, рост и обновление тканей, участвуют в поддержании осмотического давления и кислотно-щелочного равновесия, в процессах пищеварения, дыхания и кроветворения, защитных и репродуктивных функциях животных [8 Основное количество кальция (до 99% от общего количества, поступающего в организм) и фосфора (до 87 % от общего количества, поступающего в организм) входят в состав костной ткани. Поэтому при нарушении обмена этих минеральных веществ, костная ткань страдает в первую очередь [9]. Растущие кости плохо обызвествляются, что связано с недостаточной ассимиляцией солей кальция и фосфора. В таких костях резко преобладает хрящевая масса [10].

Различные минеральные и белковые добавки достаточно широко используются на сегодняшний день в кормлении молодого и взрослого поголовья сельскохозяйственных животных. Однако учитывая наличия проблемы нарушения минерального обмена в животноводческих предприятиях, остро стоит вопрос о разработке новых экономически целесообразных и терапевтических эффективных средств.

Внедрение новых минеральных и лекарственных препаратов в ветеринарную практику требует комплексного подхода, включающего научные исследования, доклинические испытания и государственную регистрацию. Только таким образом можно гарантировать эффективность и безопасность новых средств для сельскохозяйственных животных [11, 12, 13]. Анализ и оценка вариабельности морфологических и биохимических показателей крови животных имеют первостепенное значение при оценке безопасности лекарственных препаратов и кормовых добавок [14].

Цель исследований: изучение токсикологической безопасности оригинальной белково-минеральной добавки рахипред.

Задача исследований: изучение динамики морфофункциональных показателей крови лабораторных крыс в рамках исследования хронической токсичности на фоне использования оригинальной белково-минеральной добавки рахипред.

Материал и методы исследований. Эксперимент проводился на 30 лабораторных былых крысах линии Wistar с исходной массой 200-230 г. Было сформировано 3 группы по 10 животных в каждой. С целью формирования однородности выборки в отдельных группах все крысы, задействованные в опыте, были только самками. Подбор животных в группы осуществлялся методом аналогов, в качестве основных критериев использовались масса тела и двигательная активность подопытных крыс. Для проведения хронического эксперимента по оценке длительного использования испытуемой кормовой добавки в качестве модели для экспериментальной оценки выбор таких животных как лабораторные крысы обусловлен универсальностью данного вида для фармакологических исследований в мировой практике, как в отношении человека, так и для домашних, в том числе продуктивных видов животных.

Изучение кормовой добавки проводилось с использованием перорального способа введения. Животные опытных групп получали кормовую добавку в форме болюсов. В составе добавки присутствовал белковый компонент естественного происхождения, соединения кальция и фосфор природного происхождения и кристалическая сера. В качестве формообразующего компонента применялась кукурузная мука, в качестве корригента – небольшое количество нерафинированного растительного масла. Животные контрольной группы (1 группа) получали «плацебо», состоящие из муки и того же растительного масла. Крысы 2-й опытной группы получали в составе болюса терапевтическую дозу препарат в количестве 1 г/кг массы тела. В болюсах, предназначенных для животных 3-ей опытной группы содержалась пятикратная терапевтическая дозировка.

Перед началом опыта у пяти животных из каждой группы из полости сердца было произведено взятие крови для фиксации начальных морфофункциональных показателей. Забор крови производился в вакуумную пробирку с антикоагулянтом EDTA-3. Опыт длился 90 суток, при этом каждые 10 дней производилось взвешивание животных и их клинический осмотр (оценка двигательной активности, аутогруминг, употребление корма и воды, внешний вид шерстного покрова, наличие вынужденных поз, частота дефекации, состояние каловых масс и мочи).

Для оценки эффективности проведенной работы оценивали ряд морфофункциональных показателей крови: уровень лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, гематокрита, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах, уровень тромбоцитов, тромбокрита, эозинофилов, палочкоядерных и сигментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, базофилов и скорость оседания эритроцитов. Общий анализ крови проводился в начале и в конце исследования.

По окончании эксперимента после наркотизации животных взятие крови осуществлялось из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом.  После чего животные были умерщвлены гуманным способом, затем подвержены патологоанатомическому вскрытию для изучения внутренних органов. Исследования крови проводилось с использованием автоматического гематологического анализатора Mindray BC-2800Vet.

Статистический анализ полученных сведений осуществлялся с помощью программного приложения Microsoft Office Excel, с использованием стандартных методов вариационной статистики. Для оценки статистической значимости применялся критерий Стьюдента.

Результаты исследований. Результаты анализа полученных сведений представлены в таблице.

При анализе состояния белой крови в начале исследования было установлено, что количество лейкоцитов во всех подопытных группах не выходило за пределы референсных значений. В конце опыта в контрольной группе отмечались несущественные различия с фоновыми значениями (5,0%). В 1-й и 2-й опытных группах отмечается выраженное повышение данного показателя на 52,8% и 49,6% соответственно. Между контрольной и опытными группами установлено различия в 54,1% – в 1-й группе и 56,1% – во 2-й группе в пользу опытных групп.

Следовательно, использование испытуемой добавки способствовало увеличению количества лейкоцитов в обеих опытных группах в рамках нормативных границ. Что позволяет говорить об отсутствии проявлений патологического характера, при этом увеличение количества общего числа лейкоцитов может косвенно свидетельствовать о положительном влиянии препарата на активацию и поддержание клеточного иммунитета подопытных животных.

При анализе морфологического состава лейкоцитов в составе лейкограммы было установлено, что уровень эозинофилов в крови крыс всех групп на начало опыта находился в пределах референсных значений. К концу эксперимента в контрольной группе отмечается несущественный рост данного показателя на 5%. В обеих опытных группах анализ показал отсутствие эозинофилов в крови. Динамика показателей палочкоядерных нейтрофилов и базофилов свидетельствует лишь о возрастных изменениях в организмах крыс и не представляет практической значимости.

При оценке содержания сегментоядерных нейтрофилов в крови подопытных животных на начало опыта не было установлено значимых отклонений. В течение экспериментальной работы во всех группах наблюдалось снижение данного показателя. Для контрольной группы различия с фоновыми показателями составили в среднем 52,1% (Р≤0.05), а для 1-й и 2-й опытных групп – 41,2% (Р≤0.05) и 49,5% (Р≤0.01) соответственно.

Различие в показателях в конце эксперимента составила: 25,3% – между контрольной и 1-й опытной группой, и 5,5% – между контрольной и 2-й опытной в пользу опытных групп.

При оценке доли участия лимфоцитов было установлено, что данный параметр лейкоцитарной формулы во всех группах в течение экспериментальной работы не выходил за рамки референсных границ и имел положительную динамику. В контрольной группе изменения составили 40% (Р≤0.05), в 1-й опытной – 36,8%, во 2-й опытной – 46,2% (Р≤0.01). Различие между контрольной и 1-й опытной группой – 6% в пользу контроля, а между контрольной и 2-й опытной – 0,8% в пользу опытной группы.

Различие в показателях в конце эксперимента составила: 25,3% – между контрольной и 1-й опытной группой, и 5,5% – между контрольной и 2-й опытной в пользу опытных групп.

При оценке доли участия лимфоцитов было установлено, что данный параметр лейкоцитарной формулы во всех группах в течение экспериментальной работы не выходил за рамки референсных границ и имел положительную динамику. В контрольной группе изменения составили 40% (Р≤0.05), в 1-й опытной – 36,8%, во 2-й опытной – 46,2% (Р≤0.01). Различие между контрольной и 1-й опытной группой – 6% в пользу контроля, а между контрольной и 2-й опытной – 0,8% в пользу опытной группы.

Изначальный и финальный уровень моноцитов для животных всех подопытных групп находился в пределах нормативных границ. К концу опыта в контрольной и 1-й опытной группах отмечается возрастание данного показателя на 73,3% и на 11,4% соответственно, а во 2-й опытной отрицательный рост на 33,3%. В контрольной и 1-й опытной группах исходная концентрация моноцитов в крови идентична, а при сравнении финальных показателей контрольной и 2-й опытной групп различие составило 17,9% в пользу контроля.

Таким образом, по состоянию динамики лейкоформулы можно говорить преимущественно о возрастных изменениях у подопытных крыс, влияние препарата при использовании терапевтической дозировке и при ее завышенных значениях на процентном составе различных видов лейкоцитов не существенно не отражается.

 

Таблица. Динамика морфофункциональных показателей крови крыс

Показатели	Референсные значения	Контрольная группа		1-я опытная группа		2-я опытная группа
		фон	60 дней	фон	60 дней	фон	60 дней
Лейкоциты, 109/л	2,9-15,3	7,86±0,262	8,25±0,768	8,32±0,274	12,72±1,770	8,61±0,156	12,88±1,913
Эритроциты, 1012/л	5,6-7,9	6,26±0,070	4,93±0,176^^	6,58±0,178	5,78±0,493	6,69±0,393	5,52±0,468
Гемоглобин, г/л	120-180	121,4±1,45	134,6±1,30^^	123,3±1,55	140,6±2,31	123,6±1,92	143,2±2,68*
Гематокрит, %	36-46	36,3±0,60	38,4±0,45	36,7±1,08	43,4±0,88**	36,2±1,60	42,4±0,98*
Средний объём эритроцитов, фл	50,0-77,8	51,2±2,36	49,7±0,37	52,0±2,58	51,1±0,41	51,5±1,14	50,6±0,53
Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах, пг	16,0-23,1	15,3±0,36	15,1±0,11	15,2±0,17	15,2±0,07	15,2±0,05	15,2±0,11
Тромбоциты, 109/л	100-1610	310,2±21,51	409,8±45,6	291,5±25,06	465,0±27,9^^	273,42±13,6	467,6±11,47^^^
Тромбокрит, %	0,12-0,4	0,17±0,014	0,23±0,025	0,18±0,025	0,23±0,015	0,23±0,022	0,29±0,031
Эозинофилы, %	0,5-5	1,8±0,22	0,4±0,27	2,8±0,48	0,0±0,00	1,2±0,22	0,0±0,00
Палочкоядерные, %	0-1	2,20±0,418	0,80±0,224	1,25±0,250	1,00±0,000	1,00±0,000	1,00±0,000
Сегментоядерные, %	10-50	38,0±4,14	18,2±2,49^	38,8±5,15	22,8±1,88^	38,0±2,69	19,2±1,64^
Лимфоциты, %	50-93	52,0±4,50	72,8±2,10^	50,0±8,11	68,4±1,75	50,2±1,78	73,4±2,08^
Моноциты, %	2-8	4,50±0,645	7,80±0,652^	7,00±3,488	7,80±1,710	9,60±1,351	6,40±0,570
Базофилы, %	0-1	0,8±0,42	0,0±0,00	0,3±0,25	0,0±0,00	0,0±0,0	0,0±0,00
Скорость оседания эритроцитов, мм/ч	1,4-2,2	1,0±0,00	1,4±0,27	1,3±0,25	1,0±0,00	1,0±0,00	1,8±0,42

Примечание:  ^ - Р≤0.05; ^^ - Р≤0.01; ^^^ - Р≤0.001 – по отношению к фоновым значениям;

                        * - Р≤0.05; ** - Р≤0.01; *** - Р≤0.001 – по отношению к позитивным контрольным значениям.

 

Анализ состояния красной крови позволил установить, что уровень эритроцитов в начале эксперимента находился в пределах нормативных значений. В завершении эксперимента данный показатель снизился по отношению к изначальным значениям на 21,3% в контрольной, на 12,2% в 1-й опытной и на 17,4% во 2-й опытной группах. Различия между контрольной и опытными группами составили 17,1% и 12% в пользу опытных групп. Снижение эритроцитов к концу опыта происходило во всех подопытных группах. Учитывая наличие одинаковых условий содержания и адекватного кормления, соответствующего физиологическим нормам, следует предположить действие на организм крыс какого-либо внешнего стрессового фактора. Однако использование испытуемой добавки в обеих опытных группах позволят отметить разницу по отношению к значениям контрольной группы, в которой количество эритроцитов снизилось заметно ниже минимальной границы нормы.

Содержание гемоглобина на начало опыта во всех группах определялся в пределах референсных значений, ближе к минимальному показателю значений нормы.

В завершении экспериментальной работы содержание эритроцитообразующего пигмента повысилось в контрольной группе на 10,9% (Р≤0.01), а в 1-й и 2-й опытных на 14% (Р≤0.01) и на 15,9% (Р≤0.01) соответственно. Различия финальных показателей гемоглобина между контрольной и опытными группами составили: 4,5% – для 1-й группы и 6,4% (Р≤0.05) – для 2-й группы в пользу опытных групп.

Уровень гематокритной величины в начале эксперемента во всех группах определялся в пределах физиологической нормы, ближе к нижнему референсному порогу.

При анализе конечных значений было установлено, что уровень гематокритной величины в контрольной группе повысился незначительно – на 5,7%, а в 1-й и 2-й опытных группах – на 18,5% (Р≤0.01) и 17,2% (Р≤0.01) соответственно. Разница между контрольной и 1-й опытной группой составила 13,1% (Р≤0.01), между контрольной и 2-й опытной – 10,4% (Р≤0.05) в пользу опытных групп.

Изменения среднего объема эритроцитов и содержания гемоглобина в них в течение опыта не имели какой-либо динамики. Данные показатели не выходили за рамки референсных значений и находились на одном уровне во всех группах.

Анализ динамики тромбоцитов позволил установить, что в конце эксперимента произошло увеличение данного показателя во всех подопытных группах на 5,0% – в контрольной, 59,5% (Р≤0.05) – в 1-й опытной группе, 71,02% (Р≤0.001) – во 2-й группе. В конце опыта значения в опытных группах были больше, чем в контроле на 13,48% и 14,11% соответственно в 1-й и 2-й группах. При этом значения тромбокрита имели тенденцию к увеличению во всех группах в конце опыта, но между группами различий выявлено не было. Следует сказать, что увеличение количества тромбоцитов в опытных группах происходило на уровне ниже средних значений референсных границ. Доступ к воде у животных всех групп был организован одинаковым образом. Исходя из этого становится возможным исключить эффект от сгущения крови, вызванного обезвоживанием организма, а также наличие патологического тромбоцитоза. Учитывая общую тенденцию можно предположить положительное влияние используемой добавки на содержание тромбоцитов в крови, а, следовательно, и повышение гемостатической функции.

Фоновые показатели скорости оседания эритроцитов составили: 1,0±0,000 мм/ч – для контрольной и 2-й опытной групп, а для 1-й опытной группы – 1,25±0,250 мм/ч. В контрольной и во 2-й опытной группах скорость оседания эритроцитов выросла на 40% и 80% соответственно, а в 1-й опытной группе снизилась на 20%. Разница данного показателя между контрольной и 1-й опытной группой составила 28,6% в пользу контроля, а между контрольной и 2-й опытной 28,6% в пользу опытной группы. Из проведенного анализа видно, что динамика данного параметра не отличается достоверностью изменений и единой направленностью тенденций.

В результате анализа красной крови, можно сделать вывод, что испытуемая добавка в рекомендуемой терапевтической дозе и в дозе с пятикратным превышением не оказывает негативного действия на количественные показатели параметров красной крови. Напротив, были отмечены все изменения, свидетельствующие о стимулирующем влиянии данного комплексного средства на органы кроветворения.  По отношению к показателям животных контрольной группы в конце экспериментального цикла отмечается тенденция к увеличению количества эритроцитов, уровня гемоглобина, гематокритной величины. Также положительно реагируют параметры системы гемостаза, поскольку в обеих опытных группах происходит увеличение количественного содержания тромбоцитов. Также следует сказать, что при исследовании показателей, характеризующих состояние красной крови, также было установлено повышение количества общего числа лейкоцитов.

Все эти изменения носят комплексный характер, что дает возможность говорить об отсутствии случайного происхождения наблюдаемых явлений. Испытуемая добавка, сочетает в себе богатейших комплекс минералов природного происхождения, действие которых усилено соединениями кальция и минеральной серы. Активация процессов минерального и электролитного метаболизма в сочетании с использованием легкоусвояемых белковых компонентов создает все необходимые условия для улучшения качественного функционирования всех остальных групп обмена веществ. Система кроветворения наиболее чувствительна к любому дефицитарному и токсическому состоянию в организме, по этой причине кровь используется в лабораторной диагностике как ценный маркер многих патологических явлений.

Исходя из этого, фармакологическое действие испытуемой добавки в данном сегменте оценки ее влияния приводит к коррекции показателей красной, белой крови и тромбоцитов, что создает условия для качественной тканевой оксигенации, иммунной защите организма и оптимальной работы системы гемостаза.

Заключение. Использование кормовой добавки в терапевтической дозировке и в пятикратном увеличении дозы не вызывает негативных эффектов со стороны гематологических показателей. При этом установлено повышение количества лейкоцитов в рамках референсных границ, что свидетельствует о повышении активности клеточного иммунитета; отмечено увеличение концентрации гемоглобина и гематокритной величины, что способствует повышению функциональных характеристик красной крови; увеличивается количество тромбоцитов, отвечающих за качество работы системы гемостаза.

 

Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.

About the authors

Ivan D. Puzikov

Samara State Agrarian University

Email: vmpsm99@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7166-3851

graduate student

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara region

Alexey V. Savinkov

Samara State Agrarian University

Author for correspondence.
Email: a_v_sav@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9280-1400

Doctor of Veterinary Sciences, Professor

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara region

References

Supplementary files