ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА Е КУР В УСЛОВИЯХ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Полный текст

Птицеводство на сегодняшний день является самой динамично развивающейся отраслью животноводства. Но в той или иной степени, падежа «клинически здоровой» птицы не удается избежать, ни одному птицеводческому хозяйству. Зачастую, при этом, не удается поставить точный диагноз, а заболевание остается не диагностированным. На территории РФ к таким относится вирусный гепатит Е птиц. Повышенный интерес к этому заболеванию как зооатропонозной инфекции связан с обнаружением антител к ВГЕ (анти-ВГЕ) среди населения. По литературным данным птица может быть резервуаром вируса гепатита Е и источником инфекции для человека и свиней. Этиологическим агентом гепатита Е является одноцепочный положительный мРНК вирус (HEV), впервые описанный в 1983 г. Первоначально возбудитель был отнесен к семейству Picornaviridae. Однако более поздние исследования показали, что вирус не принадлежит данному семейству и морфологически более сходен с представителями семейства Caliciviridae. Такая классификация также оказалась неверной, поскольку филогенетический анализ генома не позволил отнести вирус к какому-либо известному семейству [1, 4]. В настоящее время вирус HEV является единственным представителем рода Hepevirus, семейства Hepeviridae (Emerson и др., 2004). Генетически вирус сходен с вирусом краснухи (семейство Togaviridae, род Alphavirus) и с вирусом некротического пожелтения жилок свёклы (семейство Togaviridae, род Furovirus). Благодаря широкому распространению, вирус гепатита Е вызывает острый спорадический и эндемический гепатит у различных видов животных и птицы во всем мире. Основной путь передачи инфекции фекально-оральный. Наиболее крупные вспышки заболевания связывают с контаминацией воды [2, 6, 8]. У животных впервые вирус был изолирован в США в 1997 г. Meng с соавторами (2003) описал заболевание у свиней. У птиц заболевание описано в 1980 году на птицефабриках Австралии, Великобритании, Японии и США. Данное заболевание у птицы характеризуется снижением яйценоскости, высокой смертностью, значительным увеличением печени и селезенки. В России Ибрагим Ел-Морси в 2004 г. проводил исследования в Екатеринбурге и у 18,3% обследуемых кур обнаружил антитела к ВГЕ, что свидетельствует о циркуляции данного вируса на территории России. Основное поголовье птицы было завезено из Европейских стран. Ежегодные падежи «клинически здоровой птицы» только в одном птицеводческом хозяйстве исчисляются тысячами. Масштабные исследования вирусного гепатита Е кур на территории Российской Федерации ранее не проводились. В современных условиях необходима своевременная диагностика для профилактики и ликвидации заболевания среди поголовья птиц, обслуживающего его персонала и потребителей птицеводческой продукции. На сегодняшний день диагностических наборов для ПЦР существует более десяти, но все они производятся за рубежом. Авторы предлагают создать набор для ПЦР диагностики вирусного гепатита Е птиц отечественного производства, что снизит его стоимость для потребителя в разы. Диагностический набор ПЦР для вирусного гепатита Е будет адаптирован для российских условий. Своевременная диагностика позволит существенно сократить убытки. В связи с отсутствием доступных методов выявления вируса, цель исследований - усовершенствование методов диагностики вирусного гепатита Е кур. Для этого были решены следующие задачи: 1) культивирование вируса с использованием культуры клеток ФЭК для получения материала, свободного от других микроорганизмов; 2) заражение куриных эмбрионов для оценки вирулентности штамма; 3) разработка олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса методом полимеразной цепной реакции. Материалы и методы исследований. Основное поголовье птицы, которое подвергалось обследованию, было завезено из Европейских стран. От павшей птицы отбирали кусочки печени и в транспортной среде, обеспечивающей оптимальные условия сохранности РНК и ДНК, доставляли в лабораторию. В качестве положительного контроля использовали заведомо положительный материал в виде замороженной суспензии внутренних органов птиц, предоставленный ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии. Выделение вируса проводили с помощью первично-трипсинизированной клеточной культуры ФЭК (фибробласты эмбрионов кур). Для проверки стерильности суспензию патологического материала предварительно высевали на МПБ. После заражения клеточной культуры проводили ежедневное наблюдение под малым увеличением микроскопа в течение 7 дней. Степень дегенеративных изменений клеток в зараженной культуре оценивали крестами: ++++ - деструкция всех клеток в пробирке; +++ - большей части клеток; ++ - половины клеток; + - меньше половины; - отсутствие ЦПЭ. В обязательном порядке результат опыта сравнивали с контролем - свободной от вируса клеточной культуры. Материалом для ПЦР-исследования служили погибшие эмбрионы, культура клеток с ЦПЭ, а также полевой биологический материал от 47 павших кур, у которых отмечался синдром гепато- и спленомегалии. Выделение вируса проводили с использованием развивающихся куриных эмбрионов 6-7-дневного возраста. Вирусосодержащий материал вносился одноразовым стерильным шприцом в объеме 0,3 мл в желточный мешок. Овоскопирование проводили ежедневно в течение 7 дней. Выделение ДНК из образцов печени производили набором «Рибосорб» (ФГУ ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Метод выделения основан на специфической обратимой сорбции нуклеиновых кислот на частицы силикагеля. Нуклеотидные последовательности генов-мишеней для ПЦР были получены из баз данных NCBI GenBank. Анализ нуклеотидных полноразмерных геномов и участков генов проводили с применением программы «BioEdit 6.0» и «Oligo 4.0». Постановку ПЦР проводили в реакционной смеси стандартного состава с использованием 10 пкМ каждого праймера, 10 мкл раствора кДНК с добавлением 3 мМ MgCl2. Продукты ПЦР анализировали путем электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле. Результаты исследований. Для выделения и концентрации вируса из имеющегося клинического материала использовали метод последовательных пассажей на первично трипсинизированной клеточной культуре. Перед инокуляцией материала в предварительно подготовленную клеточную культуру, проверяли бактериологическую чистоту путем посева на МПБ. ЦПЭ регистрировали, начиная с третьего дня с момента первичного заражения культуры клеток. Следующие пассажи проводили аналогично, материалом служила среда с клеточной взвесью из опытных пробирок предыдущего пассажа. Таблица 1 Оценка ЦПЭ в серии пассажей вируса гепатита Е кур в клеточной культуре ФЭК День Первичное заражение культуры клеток Первый пассаж Второй пассаж 1 - - + 2 - ++ +++ 3 + +++ ++++ 4 ++ ++++ ++++ 5 ++ ++++ ++++ 6 +++ ++++ ++++ 7 +++ ++++ ++++ Важно отметить, что при пассажировании на КК наблюдалось увеличение монослоя в сравнении с контролем. Для оценки вирулентности вируса гепатита Е кур проводили заражение куриных эмбрионов. Начиная со второго дня, гибель эмбрионов считается специфичной. Таблица 2 Сравнительная оценка вирулентности возбудителя гепатита Е кур в зависимости от концентрации вируса Показатель Очищенная суспензия внутренних органов больных цыплят Культура клеток после второго пассажа Контроль Количество зараженных эмбрионов 3 3 3 Гибель первого эмбриона группы, день 4 2 нет Гибель всех эмбрионов группы, день 7 3 нет У павших эмбрионов, зараженных клеточной культурой после второго пассажа, встречалось скопление белого налета на сосудистой оболочке. У некоторых эмбрионов оболочка желточного мешка была дряблая и разрывалась при захвате пинцетом. С целью выявления вируса гепатита Е кур методом ПЦР проводили выделение нуклеиновых кислот. Диагностика полученных образцов РНК на присутствие генетического материала вируса производилась с использованием стандартного набора реагентов и видоспецифических праймеров, фланкирующих участок генома размером в 176 пар нуклеотидов. После проведения обратной транскрипции полученная кДНК использовалась для проведения полимеразной цепной реакции. Нами были подобран наиболее оптимальный температурный режим амплификации и концентрация ионов магния. В результате проведенных исследований наличие РНК вируса было подтверждено во всех опытных образцах куриных эмбрионов и культуре клеток. Из 47 образцов биологического материала павших кур наличие вируса гепатита Е кур методом ПЦР было установлено только в 4-х случаях (8,5%). Заключение. Масштабные исследования вирусного гепатита Е кур на территории Российской Федерации ранее не проводились. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что штамм вируса гепатита Е кур обладает высокой вирулентностью. Циркуляция вируса гепатита Е кур, завезенных из европейских стран в Ростовскую область, подтверждена методом ПЦР. Мониторинговые исследования птицефабрик с использованием высокочувствительных методов позволяют существенно сократить экономические потери, своевременно скорректировать эпизоотологические и эпидемиологические мероприятия.

Об авторах

Татьяна Ивановна Лапина

ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии

Email: diacen-rd2012@yandex.ru
д-р биол. наук, проф., зав. межлабораторным диагностическим центром 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0

Александр Иванович Клименко

ФГБОУ Донской ГАУ

Email: diacen-rd2012@yandex.ru
член-корреспондент РАСХН, д-р. с.-х. наук, проф. 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0

Александр Геннадьевич Ключников

ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии

Email: alex-roz@mail.ru
научный сотрудник лаборатории функциональной диагностики 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0

Мария Анатольевна Бодрякова

ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии

Email: mbodryakova@bk.ru
младший научный сотрудник межлабораторного диагностического центра 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0

Список литературы

Дополнительные файлы