Молекулярно-генетический анализ сортов яблони селекции института «Жигулевские сады» по генам Md-ACS1 и Md-ACO1 биосинтеза этилена в плодах при созревании и их хранении

Полный текст

Яблоня домашняя (Malus domestica Borkh.) является одной из наиболее экономически значимых культур. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАОСТАТ) в 2023 году яблоню выращивали в 93 странах и производство яблок в мире составило 115,25 млн. т., в том числе в Китае 49,6 млн. т. [1]. В России яблоня отнесена к числу растений, производство и выращивание которых направлено на обеспечение продовольственной безопасности страны. В 2023 году в России яблоню выращивали на площади 201,4 тыс. га и объем производства плодов составил 2,08 млн. т.

Яблоки являются важным компонентом здорового и сбалансированного питания [2]. Потребление яблок в достаточном количестве снижает риск развития заболеваний, связанных с неправильным питанием, снижением иммунитета, нарушениями липидного и углеводного обмена, позволяет помочь предотвратить преждевременное старение организма [3]. В свежем виде плоды яблони употребляют для профилактики инфекционных заболеваний и улучшения работы пищеварительной системы [4].

Важными показателями качества плодов яблони являются текстура, упругость и пригодность их для хранения в течение определенного периода времени. Потребители все чаще требуют твердых яблок с сочной и хрустящей мякотью. Сохранение твердости и консистенции мякоти во время созревания важно не только для вкусовых качеств и устойчивости плодов к механическим повреждениям, но и для снижения восприимчивости их к патогенам, уменьшения актируемых потерь и более длительного сохранения потребительских достоинств яблок при хранении.

Размягчение тканей мякоти плодов, связанное с изменением плотности расположения клеток, клеточной стенки и мембран, тургора клеток, при созревании и хранении яблок происходит в результате протекания нежелательных различных физиологических и биохимических процессов, среди которых важная роль принадлежит биосинтезу этилена [5, 6]. Выращивание сортов с низким уровнем биосинтеза этилена в плодах во время созревания и подавление его действия способствуют повышению сроков хранения яблок [7].

Хранение яблок в камере холодильника с регулируемой газовой средой, применение химических обработок в саду и перед закладкой в хранилище позволяют предотвратить потери от микробиологической порчи и являются эффективными в поддержании стабильного качества плодов в период хранения, но использование данных методов значительно повышает себестоимость яблок. Одним из вариантов частичной замены данных способов, особенно при производстве органической продукции, является применение сортов яблони с низким уровнем биосинтеза этилена в плодах во время созревания и в период их хранения.

Ключевую роль в выработке этилена и потере твердости яблок при хранении играют ферменты 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтаза (АЦК-синтаза) и 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота оксидаза (АЦК-оксидаза). Активность работы ферментов АЦК-синтаза и АЦК-оксидаза кодируется серией генов Md-ACS и Md-ACO [8]. Ограничивающим фактором в концентрации эндогенного этилена во время созревания плодов яблони в основном являются гены АЦК-синтаза семейства ACS [9, 10].

Фермент АЦК-синтаза преобразует S-аденозил-L-метионин в 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АЦК), которая окисляется до этилена, аммиака, муравьиной кислоты и углекислого газа [11]. В этой связи регуляция активности данного фермента является ключевой в биосинтезе этилена в плодах яблони.

В локусе Md-ACS1 выявлены аллели Md-ACS1-1 (489 п. н.) и Md-ACS1-2 (655 п. н.). Аллель Md-ACS1-1 приводит к нормальному производству этилена, а аллель Md-ACS1-2 связана со сниженным уровнем этилена [12]. Гомозиготное состояние аллеля Md-ACS1-1 (489 п. н.) свидетельствует о максимальном биосинтезе этилена в плодах и невысокой их лежкости. Отсутствие данной гомозиготы в генотипе может служить первым критерием на селекцию сортов яблони с твердыми, длительно хранящимися плодами. Для сортов яблони, гомозиготных по аллелю Md-ACS1-2, характерен пониженный, а у гетерозиготных – средний уровень биосинтеза этилена в плодах [13, 14].

В локусе Md-ACO1 идентифицированы также две аллели: Md-ACO1-1 (525 п. н.) и Md-ACO1-2 (587 п. н.). Сорта яблони, гомозиготные по аллелю Md-ACO1-1, отличаются низкой концентрацией эндогенного этилена и при хранении демонстрируют лучшее сохранение твердости мякоти плода, чем гетерозиготные и гомозиготные по аллелю Md-ACO1-1/2 [15]. Гомозиготное состояние аллеля Md-ACO1-1 в сочетании с гомозиготностью аллеля
Md-ACS1-2 приводит к еще большему снижению биосинтеза этилена в плодах яблони, что позволяет дольше сохранять их твердость при хранении в течение нескольких месяцев [13].

Цель исследований: анализ состава аллелей генов Md-ACS1 и Md-ACO1, вовлеченных в биосинтез этилена при созревании плодов сортов яблони селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады».

Задачи исследований: провести оценку сортов яблони по аллелям генов Md-ACS1 и Md-ACO1, вовлеченных в контроль биосинтеза этилена при созревании и хранении плодов; предоставить селекционерам и производителям яблок информацию о генотипах, проявляющих способность к лучшему сохранению яблок при хранении.

Материалы и методы исследований. Исследования проводили в лаборатории молекулярно-генетического анализа плодовых растений ФГБОУ ВО «Мичуринский государственный аграрный университет». Объектом исследований служили 7 сортов яблони осеннего и 18 сортов зимнего срока созревания плодов селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады» (табл. 1). При создании сортов осеннего срока созревания в качестве родительских форм использованы 30,8 % генотипов, полученных до начала XX века и 69,2 % в период до 30^х годов XX века. Сорта зимнего срока созревания получены с участием исходных родительских форм, среди которых 13,9 % были созданы до начала XX века, 69,4 % в первой половине XX века и только 16,7 % в 50-70^х годах XX века.

 

Таблица 1. Происхождение сортов яблони селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады»

№ п/п	Сорт	Происхождение
Осенний срок созревания
1	Аркад волжский	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
2	Буян	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Лобо (Макинтош × св. оп.)
3	Волжский шафран	Антоновка шафранная (Антоновка обыкновенная × Ренет орлеанский) × Пепин лондонский (старинный английский сорт)
4	Жигулевское	Боровинка (народная селекция) × Вагнера призовое (св. оп.)
5	Самара	Спартак (Шаропай × св. оп.) × Голден Делишес Спур (клон сорта Голден Делишес)
6	Сокское розовое	Позднее сладкое (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
7	Спартак	Шаропай (старинный русский сорт) × св. оп.
Зимний срок созревания
8	Азаровское	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
9	Данко	Куйбышевское (Антоновка шафранная × Ренет орлеанский) × Лобо
10	Князь Засекин	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Вайнспур Делишес (почковая мутация сорта Старкин Делишес)
11	Красноглинское	Позднее сладкое (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
12	Куйбышевское	Антоновка шафранная (Антоновка обыкновенная × Ренет орлеанский) × Пепин лондонский (старинный английский сорт)
13	Кутузовец	Скрыжапель (старинный русский сорт) × Ренет Симиренко (случайный сеянец)
14	Маяк Поволжья	Антоновка (старинный сорт) × Лобо (Макинтош × св. оп.)
15	Оригинал	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Орлик (Макинтош × Бессемянка Мичуринская)
16	Память Кедрина	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Орлик (Макинтош × Бессемянка Мичуринская)
17	Память Королева	Куйбышевское (Антоновка шафранная × Ренет орлеанский) ×Лобо (Макинтош × св. оп.)
18	Подарок министру	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
19	РассветПоволжья	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
20	Самарский сувенир	Кутузовец (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Память Мичурина (Шампарен-китайка × св. оп.)
21	Самарчанин	(5-10-3 × 4-2-13-28-1 (Спартак × Анис Алый) × Орлик (Макинтош × Бессемянка Мичуринская)
22	Синап самарский	Жигулевское (Боровинка × Вагнера призовое) × Северный синап (Кандиль-китайка × св. оп.)
23	Спартанец	Позднее сладкое (Скрыжапель × Ренет Симиренко) × Спартан (Макинтош × Желтый Ньютаун)
24	Скиф	Спартак (Шаропай × св. оп.) × Кубань спур (клон сорта Кубань)
25	Янтарь самарский	Скрыжапель красный (старинный русский сорт) × Корей (Голден Делишес × Индо)

 

Выделение ДНК проводили из молодых листьев с использованием метода ЦТАБ [16] с модификациями. Постановку амплификации осуществляли с использованием мастер-микса для ПЦР 5XMasDDTaqMIX-2025 от производственно-коммерческого закрытого акционерного общества «ДИАЛАТ ЛТД» (Россия). Состав реакционной смеси объемом 25 мкл: матричная ДНК (20 нг/мкл) – 1,5 мкл; праймер прямой – 0,5 мкл (концентрация 10 пМ/мкл); праймер обратный – 0,5 мкл (концентрация 10 пМ/мкл); мастер-микс – 5 мкл; деионизированная вода – 17,5 мкл.

Для обнаружения у сортов яблок аллелей гена Md-ACS1 применяли маркер Md-ACS1, гена Md-ACO1 – маркер Md-ACO1 [12]. Праймеры синтезированы ООО «Синтол» (Россия). Нуклеотидные последовательности праймерных пар представлены в таблице 2.

 

Таблица 2. Нуклеотидная последовательность праймерных пар, используемых в работе

Название	Последовательность
Md-ACSl F	5ʹ-AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC-3ʹ
Md-ACSl R	5ʹ-CCTACAAACTTGCGTGG GGATTATAAGTGT-3ʹ
Md-ACOl F	5ʹ-TCCCCCCAATGCACCACTCCA-3ʹ
Md-ACOl R	5ʹ-GATTCCTTGGCCTTCATAGCTTC-3ʹ

 

Реакцию проводили с помощью амплификаторов SimpliAmp («Applied Biosystems», USA), «ДТ-прайм» («ДНК-технология», Россия) по следующей программе: для маркера Md-ACSl – 4 мин при 94 ℃; следующие 35 циклов: 1 мин при 94 ℃, 1 мин при 58 ℃, 1 мин синтез при 72 ℃; финальный цикл синтеза 7 мин. при 72 ℃; для маркера Md-ACО1 – 2 мин при 94 ℃; следующие 25 циклов: 45 с при 65 ℃, 2 мин при 72 ℃, 45 с синтез при 94 ℃; 1 цикл: 65 ℃ – 45 с; 72 ℃ – 10 мин.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2-процентном агарозном геле. После электрофореза гель анализировали в ультрафиолетовом свете с использованием трансиллюминатора.

Результаты исследований. Для всех исследуемых сортов яблони, несущих различные аллельные комбинации генов Md-ACS1 и Md-ACO1, получены четкие результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР (рис. 1, 2).

 

Рис. 1. Электрофореграмма идентификации аллелей гена Md-ACS1 у сортов яблони: 
1 – Азаровское, 2 – Буян, 3 – Спартанец, 4 – Самарский сувенир, 5 – Самарчанин, 6 – Синап самарский, 7 – Скиф, 8 – Красноглинское, 9 – Кутузовец, 10 – Самара, 11 – Память Королева, 12 – Сокское розовое, 13 – Спартак, 14 – Куйбышевское, 15 – Жигулевское, 16 – Подарок Министру, 17 – Аркад волжский, 18 – Князь Засекин, 19 – Маяк Поволжья, 20 – Память Кедрина, 21 – Янтарь самарский, М – маркер молекулярного размера (шаг 100 п.н.)

 

Рис. 2. Электрофореграмма идентификации аллелей гена Md-ACО1 у сортов яблони:
1 – Азаровское, 2 – Буян, 3 – Спартанец, 4 – Самарский сувенир, 5 – Самарчанин, 6 – Синап самарский, 7 – Скиф, 8 – Красноглинское, 9 – Кутузовец, 10 – Самара, 11 – Память Королева, 12 – Сокское розовое, 13 – Спартак, 14 – Куйбышевское, 15 – Жигулевское, 16 – Подарок Министру, 17 – Аркад волжский, 18 – Князь Засекин, 19 – Маяк Поволжья, 20 – Память Кедрина, 21 – Янтарь самарский, 22 – Оригинал, 23 – Рассвет Поволжья, М – маркер молекулярного размера (шаг 100 п.н.)

 

Данные аллельного полиморфизма по локусу Md-ACS1 показали, что гомозиготное состояние по аллелю Md-ACS1-2, связанное с низким уровнем выделения этилена в плодах при созревании и продолжительным сроком их хранения без потери потребительских качеств, не было обнаружено ни у одного из изучаемых сортов яблони селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады» (табл. 3).

 

Таблица 3. Аллельное разнообразие генов Md-ACS1 и Md-ACO1 сортов яблони селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады»

№ п/п	Сорт	Гены биосинтеза этилена
		Md-ACS1		Md-ACO1
		Md-ACS1-1 489 п.н.	Md-ACS1-2 655 п.н.	Md-ACO1-1 525 п.н.	Md-ACO1-2 587 п.н.
Осенний срок созревания
1	Аркад волжский	1*	0	0	1
2	Буян	1	1	1	1
3	Волжский шафран	1	1	0	1
4	Жигулевское	1	0	0	1
5	Самара	1	0	0	1
6	Сокское розовое	1	0	0	1
7	Спартак	1	0	0	1
Зимний срок созревания
8	Азаровское	1	0	0	1
9	Данко	1	0	0	1
10	Князь Засекин	1	0	0	1
11	Красноглинское	1	1	1	1
12	Куйбышевское	1	1	0	1
13	Кутузовец	1	0	0	1
14	Маяк Поволжья	1	1	0	1
15	Оригинал	1	1	1	1
16	Память Кедрина	1	0	0	1
17	Память Королева	1	1	0	1
18	Подарок Министру	1	1	1	1
19	Рассвет Поволжья	1	1	0	1
20	Самарский сувенир	1	0	0	1
21	Самарчанин	1	0	0	1
22	Синап самарский	1	0	0	1
23	Спартанец	1	0	1	1
24	Скиф	1	0	0	1
25	Янтарь самарский	1	0	0	1

* «1» - наличие маркера; «0» - отсутствие маркера.        

- наличие у образцов двух маркеров лежкости.

 

Выявлено, что все анализируемые сорта яблони несут аллель Md-ACS1-1, а более 70,0 % сортов осеннего и около 40,0 % сортов зимнего срока созревания имеют данный аллель в гомозиготном состоянии. Гомозиготность по аллелю Md-ACS1-1 указывает на высокий уровень биосинтеза этилена в плодах при созревании и не является селекционно-ценным признаком при создании сортов с твердой мякотью и хорошей лежкостью яблок после сбора урожая. Высокая частота встречаемости аллеля Md-ACS1-1 в гомозиготном состоянии, скорее всего, связана с использованием в качестве исходных родительских форм сортов отечественной селекции, полученных в XVIII-XIX веках или созданных в начале XX века.

Наличие и сочетание в одном генотипе яблони аллелей Md-ACS1-1 и Md-ACS1-2 обуславливает средний или пониженный уровень синтеза эндогенного этилена в плодах при хранении [17]. Из исследуемых нами образцов (25 сортов) гетерозиготами (Md-ACS1-1/2) являются сорта Буян, Волжский шафран осеннего срока созревания и сорта Красноглинское, Куйбышевское, Маяк Поволжья, Оригинал, Память Королева, Подарок Министру, Рассвет Поволжья зимнего срока созревания, что представляет интерес для производителей яблок и ценность для селекции, так как определяет средний уровень синтеза этилена в плодах во время их созревания и хранения.

Ген Md-ACO1 оказывает менее сильное влияние на биосинтез этилена в плодах при созревании яблок и действует независимо от гена Md-ACS1. Аллельные различия гена Md-ACO1 обусловлены наличием в генотипе InDel (Insertion/Deletion) сайта в третьем интроне с размером инсерции в 62 пары нуклеотидов. Мутация аллеля 1 (InDel в третьем интроне) гена Md-ACO1 (Md-ACO1-1) связана со снижением выработки этилена [12]. Гомозиготные по аллелю Md-ACO1-1 сорта яблони синтезируют меньшее количество этилена, чем гетерозиготные и гомозиготные по аллелю Md-ACO1-2.

Анализ аллельного полиморфизма по локусу Md-ACO1 показал отсутствие в генотипе исследуемых сортов дефектного аллеля Md-ACO1-1 в гомозиготном состоянии, что указывало бы на низкий уровень биосинтеза этилена в плодах при созревании и их хранении. Все сорта осеннего и зимнего сроков созревания содержат аллель Md-ACO1-2 и 84,0 % из них являются гомозиготами по данному аллелю. В исследуемой выборке сорта Буян, Красноглинское, Оригинал, Подарок Министру и Спартанец содержат ген Md-ACO1 в гетерозиготном состоянии (Md-ACO1-1/2).

Сочетание гетерозиготных состояний генов Md-ACS1 (Md-ACS1-1/2) и Md-ACO1 (Md-ACO1-1/2), детерминирующих относительно пониженный уровень биосинтеза этилена в плодах во время созревания и при их хранении, идентифицировано у сорта Буян осеннего срока созревания и у сортов Красноглинское, Оригинал, Подарок Министру зимнего срока созревания плодов. Данные сорта представляют интерес для производителей яблок и могут быть использованы в селекционных программах как источники селекционно-ценных аллелей по созданию новых форм, обладающих твердой мякотью и хорошей лежкостью плодов при хранении. В зависимости от комбинаций скрещиваний в полученном гибридном материале ожидаемое количество генотипов, несущих ценные аллели Md-ACS1-2/2 и Md-ACO-1-1/1, может быть значительно увеличено.

Проведенный ранее анализ полиморфизма генов Md-ACO1 и Md-ACS1 показал, что дефектные аллели, обуславливающие сниженную выработку этилена, имеют наибольшее распространение среди сортов зарубежной селекции. При этом частота встречаемости гомозиготных форм по таким аллелям преобладает над отечественными сортами для аллеля Md-ACS1-1/2 в два раза, а для аллеля Md-ACO-1-1 практически в три раза [18]. Вероятно, отбор по степени сохранности плодов не был приоритетным для отечественных селекционеров, поэтому доля исходных форм с признаком длительной лежкости незначительна.

Значительная часть анализируемых нами генотипов получена с участием стародавних сортов отечественной и зарубежной селекции. Возможно, это является причиной незначительного распространения аллелей сниженного биосинтеза этилена.

Заключение. Оценка генетического полиморфизма исследуемых сортов яблони осеннего и зимнего срока созревания селекции ГБУ СО НИИ «Жигулевские сады» по аллелям генов, вовлеченных в контроль биосинтеза этилена в плодах во время созревания и их хранения, показала, что все генотипы одновременно являются носителями аллелей Md-ACS1-1 и Md-ACO1-2.

Наличие и сочетание в одном генотипе яблони аллелей Md-ACS1-1 и Md-ACS1-2 отмечено у сортов Буян, Волжский шафран осеннего срока созревания и у сортов Красноглинское, Куйбышевское, Маяк Поволжья, Оригинал, Память Королева, Подарок Министру, Рассвет Поволжья зимнего срока созревания. Сорта Буян, Красноглинское, Оригинал, Подарок министру и Спартанец содержат ген Md-ACO1 в гетерозиготном состоянии (Md-ACO1-1/2).

Сочетание гетерозиготных состояний генов Md-ACS1 и Md-ACO1, что определяет средний уровень синтеза этилена в плодах во время созревания и их хранения, идентифицировано у сорта Буян осеннего срока созревания и у сортов Красноглинское, Оригинал, Подарок Министру зимнего срока созревания плодов. Данные сорта представляют интерес для производителей яблок и могут быть использованы в селекционных программах как источники селекционно-ценных аллелей по созданию новых форм, обладающих твердой мякотью и хорошей лежкостью плодов при хранении.

 

Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.

Об авторах

Михаил Иванович Дулов

Научно-исследовательский институт садоводства и лекарственных растений «Жигулевские сады»

Автор, ответственный за переписку.
Email: dulov-tehfak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7118-9520

доктор сельскохозяйственных, профессор, ведущий научный сотрудник

Россия, Самара

Иван Николаевич Шамшин

Мичуринский государственный аграрный университет

Email: ivan_shamshin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4464-1876

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярно-генетического анализа плодовых растений

Россия, Мичуринск

Список литературы

Дополнительные файлы