INFLUENCE OF STROMAL-VASCULAR FRACTION CELLS ON REPARATIVE REGENERATION OF INDUCED ACHILLES TENDON INJURY

Full Text

Одним из направлений в регенеративной медицине является использование аутологичных клеточных продуктов, действие которых направлено на оптимизацию регенераторного процесса в зоне повреждения [1, 5, 7]. Среди клеточных препаратов наибольшей биологической безопасностью отличаются аутологичные. Из них в клинической практике положительно зарекомендовали себя клетки стромально-васкулярной фракции (СВФ) и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), обладающие способностью к самоподдержанию, дифференцировке в различные клеточные типы и мобилизующие в тканях репаративный процесс. Однако для внедрения клеточной терапии в ветеринарную практику требуется научное обоснование, основанное на комплексных экспериментальных исследованиях, являющихся базовыми для оценки возможностей применения аутологичных клеточных продуктов для восстановления анатомической целостности органов, поддержания структурного гомеостаза, профилактики рубцовых изменений в травмированной зоне, а также конкретизации показаний к применению и разработки схем лечения [3, 5, 6, 7]. Вместе с тем, практически отсутствуют сведения о динамическом морфологическом контроле процесса репарации при их применении [2, 4]. Цель исследований - морфологическое обоснование эффективности применения клеточных продуктов при разрыве ахиллова сухожилия. Задачи исследований: 1) установить особенности анатомической организации ахиллова сухожилия у крыс; 2) представить морфологическую характеристику спонтанного заживления индуцированного повреждения сухожильной ткани; 3) охарактеризовать микроморфологическое состояние регенерата ахиллова сухожилия подопытной группы в динамике восстановительного процесса (на 7, 14, 30 и 60 сутки) под влиянием СВФ. Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры анатомии и гистологии животных имени профессора А. Ф. Климова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К. И. Скрябина и ООО «Центр ветеринарной клеточной медицины» на двух группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (контрольной и подопытной), подобранных по принципу аналогов. Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы. Животных карантинировали в течение 14 суток, проводили общеклиническое исследование. Использовали комплекс методов, включающих анатомическое препарирование, экспериментальное моделирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия. В контрольной группе область повреждения заживала естественным путем, а в подопытной группе - под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Травму моделировали посредством поперечного разреза дистальной трети ахиллова сухожилия, ближе к месту прикрепления к пяточной кости заплюсны. В условиях полного расслабления мышц область повреждения сухожилия сшивали специальным швом. Животным подопытной группы стромально-васкулярную фракцию вводили однократно в объеме 1 мл подкожно в область дефекта на расстоянии 5 мм от области травмы с двух сторон. У крыс контрольной группы область повреждения регенерировала самопроизвольно. Проводили динамическое наблюдение за животными до момента выведения из эксперимента, которое осуществляли на 7, 14, 30 и 60 сутки путем эвтаназии в соответствии с требованиями этического комитета. Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных научных целей» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания двухнедельного карантина. Для гистологических исследований образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации образцы промывали водопроводной водой (24 часа), обезвоживали в спиртах возрастающей крепости (от 50% до 100%) и заливали в парафин-воск. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм изготавливали на универсальном автоматизированном микротоме «HM-360» (Mikron, Германия). Изучение общей морфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону по общепринятым методикам. Результаты исследований. На основании данных анатомического препарирования установлено, что в формировании ахиллова сухожилия у крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев (рис. 1-4). Рис. 1. Макроморфология пяточных ветвей двуглавой мышцы, участвующих в формировании ахиллова сухожилия Рис. 2. Макроморфология пяточных ветвей полусухожильной мышцы, участвующей в формировании ахиллова сухожилия Рис. 3. Макроморфология латеральной и медиальной икроножных мышц, участвующих в формировании ахиллова сухожилия Рис. 4. Макроморфология поверхностного сгибателя пальцев, участвующего в формировании ахиллова сухожилия На основании результатов микроморфологического исследования регенерата ахиллова сухожилия животных установлено, что у животных подопытной группы на 7 сутки пучки коллагеновых волокон в зоне дефекта характеризуются упорядоченной ориентацией, в то время как у животных в группе контроля они разнонаправлены. Это может свидетельствовать о стимуляции регенеративных процессов в области индуцированного повреждения при введении стромально-васкулярной фракции (рис. 5). а б Рис. 5. Микроморфологическая картина регенерата сухожилия на 7 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна При сравнительном анализе регенерата сухожилия на 14 сутки было установлено, что у животных подопытной группы, которым вводили аутологичный клеточный продукт, четко выражено взаимно параллельное расположение коллагеновых волокон с видимыми границами дифференциации на пучки первого и второго порядков. Более того, волокна приобретают волнистый ход, что может свидетельствовать о наличии у них резерва длины при натяжении. У крыс в контрольной группе на 14 сутки наблюдений пучки волокон сохраняют разнонаправленную организацию, что может свидетельствовать о риске возможных рецидивов. Кроме того, микроморфологическая картина сухожилия в подопытной группе характеризуется увеличением, по сравнению с контролем, клеток соединительной ткани, а также толщины пучков коллагеновых волокон. Все это отражает стимулирующее влияние аутологичной суспензии клеток СВФ на репарацию ткани сухожилия (рис. 6). а б Рис. 6. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 14 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний На 30 сутки регенеративные процессы в зоне дефекта были направлены на улучшение васкуляризации клеточных структур регенерата и увеличение количества фибробластов в подопытной группе по сравнению с группой контроля, в которой только происходит формирование пучков волокон. Под действием стромально-васкулярной фракции активнее протекает формирование и созревание грануляционной ткани. Фиброзная ткань замещает область дефекта вследствие действия суспензии (рис. 7). а б Рис. 7. Микроморфологическая характеристика. Структурная организация регенерата сухожилия на 30 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний; 4 - перитеноний Представленные данные свидетельствуют, что на финальном этапе эксперимента (60 сутки) в подопытной группе, в сравнении с контрольной группой, произошло полное заживление дефекта сухожилия. Важнейшим критерием, отражающим полное восстановление травмированного сухожилия, является упорядоченность фиброархитектоники, взаимно параллельное расположение волокон и утолщение их пучков. Кроме того, подопытным образцам присуща большая, по сравнению с регенератом, образующемся при самопроизвольном заживлении, степень их васкуляризаци. В контрольной группе, даже на 60 сутки наблюдения, вновь образованная соединительная ткань не имеет четкого структурного оформления, что может являться фактором риска возникновения рецидивов повреждения (микронадрывов ткани) (рис. 8). а б Рис. 8. Микроморфологическая характеристика регенерата сухожилия на 60 сутки (гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10): а - контроль; б - подопытная группа; 1 - теноциты; 2 - коллагеновые волокна; 3 - эндотеноний; 4 - перитеноний Заключение. На основании проведенных исследований установлено: 1) в структурном оформлении ахиллова сухожилия крыс участвуют: пяточные ветви двуглавой и полусухожильной мышцы, латеральная и медиальная икроножные мышцы и поверхностный сгибатель пальцев; 2) у подопытных животных обнаружены микроморфологические преобразования соединительной ткани, направленные на упорядоченность фиброархитектоники и утолщение пучков коллагеновых волокон, в то время как у животных контрольной группы - нарушения упорядоченности волокон, что способствует возникновению рецидивов; 3) микроморфологические показатели свидетельствуют о положительном результате экспериментальной апробации применения аутологичной суспензии клеток СВФ при лечении животных с разрывом сухожилий.

About the authors

N. A. Slesarenko

Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K. I. Scriabin

Email: slesarenko2009@yandex.ru
Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the department «Animal Anatomy and Histology named after Professor A. F. Klimov» Moscow

A. M. Zharikov

Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K. I. Scriabin

Email: am.zharikov@gmail.com
Graduate Student of the Department «Animal Anatomy and Histology named after Professor A. F. Klimov» Moscow

References

Supplementary files