Research of polymorphism of promising candidate gene RIPK2 in sheep

Full Text

На сегодняшний день самыми распространенными отраслями в области селекции и разведения сельскохозяйственных животных являются скотоводство, свиноводство и птицеводство для получения мяса, молока и яиц. В связи с последними тенденциями роста населения планеты, всё более остро встают вопросы обеспечения продовольственной безопасности. Общество начало развивать и другие направления животноводства, в том числе и овцеводство. Главным направлением овцеводства преимущественно является шерстная продуктивность, однако в последнее время идет наращивание роста продуктивности в сторону мясного овцеводства [13]. Зачастую категории пород, связанные с мясной и молочной продуктивностью, относят к грубошерстным породам, однако это не всегда так. Например, баранина южноафриканской породы овец дорпер обладает отличными качествами, но практически не имеет шерсти, пригодной для переработки [4]. В настоящее время основными лидерами по поголовью овец являются Китай, Австралия, Индия, Иран и Новая Зеландия. По производству баранины лидерами являются Китай, Австралия, Новая Зеландия, Судан и Турция. В России и странах СНГ животноводство развивается медленно, не на уровне мировых лидеров.

По данным Всероссийской сельскохозяйственной переписи 2021 года, поголовье овец в России на 1 августа 2021 г. составило 3454,6 тысяч голов. По данным переписи на 1 июля 2016 г., овец, находящихся во всех категориях хозяйств, было 24950,2 тыс. голов [6]. В 2022 г. продажи баранины в России снизились на 1,9% и составили 121,6 тыс. тонн. По данным Росстата, баранина является самым дорогим видом мяса после говядины. Снижение реальных располагаемых доходов населения и экономическая неопределенность приводят к снижению продаж этого вида мяса. Продвижению баранины препятствует и весьма узкий ассортимент марок. В структуре продаж баранины на российском рынке преобладает охлажденная продукция, доля которой в 2018-2022 гг. составляла 91,2-95,6%. На долю замороженной баранины в рассматриваемые годы приходилось, соответственно, от 4,4 до 8,8% всех продаж [5]. Столь существенное преобладание продаж охлажденной баранины над замороженной объясняется особенностью рынка в России, а именно: большими объемами производства и, соответственно, продаж баранины хозяйствами населения и мелкими фермерскими хозяйствами, где, как правило, нет возможности приобретения дорогостоящих камер шоковой заморозки для качественного замораживания и хранения мяса. К тому же в таких хозяйствах забой животных происходит чаще всего под конкретный заказ, то есть непосредственно перед продажей мяса [1]. На протяжении последних нескольких лет в России наблюдалась разная динамика в потреблении баранины. В 2019 г. объем потребления составил 188,4 тыс. тонн, что на 3,5% ниже уровня предыдущего года. По итогам 2020 г. потребление баранины на российском рынке выросло до 191,8 тыс. тонн (+1,8% к 2019 г.). За январь-июнь 2021 г. потребление составило 61,1 тыс. тонн (+9,1% по сравнению с аналогичным периодом 2020 г.). В 2020 г. производство баранины в России снизилось на 0,9% (до 196,2 тыс. тонн), что обусловлено рядом факторов: временные ограничения на поставки продукции убоя МРС для Южного и Северо-Кавказского Федеральных Округов за пределы своих регионов, введенные Россельхознадзором; сокращение поголовья скота, в том числе маточного, из-за роста объемов поставок живого скота МРС на внешние рынки и др. За первое полугодие 2021 г. производство баранины составило 60,7 тыс. тонн, что на 0,7% больше аналогичного периода прошлого года. В общем объеме производства баранины в настоящее время основная доля приходится на ЛПХ и КФХ. По прогнозам, в ближайшее время будет проходить индустриализация отрасли с постепенным появлением вертикально-интегрированных овцеводческих комплексов. Так, в последние годы в России стали появляться инвестиционные проекты, в том числе экспортно-ориентированные, которые направлены на развитие промышленного производства баранины (ООО «Фатежская ягнятина» – ГК «Мираторг», ООО «Кавказ-мясо» – ГК «Дамате», ООО «Хакасская баранина», ООО «Хаммер», СППК «Краснопольский холдинг» и др.). Еще одной заметной тенденцией последних лет на российском рынке стало создание сети откормочных производств и ферм (переход на контрактное фермерство), что позволит в дальнейшем снизить долю неучтенного скота на рынке. Росту объемов производства баранины в дальнейшем также может способствовать более активное развитие мясного направления: переход от производства шерстяных пород, традиционно используемых в стране, к мясным породам с более высоким выходом мяса [2].

Все большую популярность на современном этапе развития животноводства приобретают технологии, базирующиеся на применении ДНК-маркеров, ассоциированных с уровнем проявления продуктивных качеств. Данные технологии успешно применяются в национальных селекционных программах многих стран с развитым животноводством. Однако в овцеводстве такие исследования получили развитие лишь в последнее время. Большой интерес вызывают генетические маркеры, взаимосвязанные с генами-кандидатами, белковые продукты которых осуществляют ключевые позиции в создании физиолого-биохимических процессов и управлении [7].

Развитие генетики, в частности молекулярной генетики, дало большой толчок для идентификации и аннотации функциональных генов, связанных с мясной продуктивностью у овец. Несмотря на то, что рост и размножение организма регулируются, прежде всего, гипофизом [12], существуют также транскрипционные факторы и индуцирующие сигналы, влияющие непосредственно на гипофиз, и, следовательно, на признаки мясной продуктивности. К таким факторам относятся LHX3 и LHX4, влияющие на рост и развитие животного [17]. Одним из самых известных генов, который широко используется в маркер-ориентированной селекции, является кальпаин (CAPN). С помощью применения методов ПЦР было показано, что данный ген связан не только с признаками роста и мясной продуктивностью, но и влияет на структуру мышечного волокна, делая его более нежным [8]. Ген CAPN кодирует внутриклеточные цистеиновые протеазы, которые активируются кальцием и участвуют в физиологических процессах организма, а именно: в перестройке скелетных мышц [11]. Говоря о скелетных мышцах, нельзя не упомянуть негативный регулятор развития мышечных волокон миостатин, кодируемый геном MSTN. Было показано, что развитие мышц у овец увеличивается до 2 раз при нарушении в работе гена MSTN [16]. Не менее известным, чем ген миостатина, является ген гормона роста GH, некоторые мутации в котором приводят к ускоренному развитию животного и меньшим жировым отложениям [15]. Также стоит отметить ген MEF2B, который также влияет на признаки роста и мясной продуктивности у овец и широко используются в маркер-ориентированной селекции [18]. Для вариантов в гене MEF2B была показана положительная ассоциация с диаметром волокна миоцита и отрицательная ассоциация с плотностью волокон миоцитов у коз [9].

Таким образом, актуально проводить поиск и исследование новых перспективных генетических маркеров, ассоциированных с параметрами мясной продуктивности у овец, для дальнейшей разработки тест-систем с последующим предложением включения в селекционный процесс овцеводства.

Ранее авторами был проведен поиск геномных вариантов, ассоциированных с живой массой у овец на основе анализа высокоплотных SNP-генотипов. Поиск ассоциаций проводился на ресурсной популяции овец возвратных кроссов (романовская × катадин) × романовская. Живую массу и коэффициент ее изменчивости измеряли в возрасте 6, 42, 90, 180 и 270 суток. Полногеномные SNP-профили были получены с помощью ДНК-чипа высокой плотности Ovine Infinium® HD SNP BeadChip («Illumina, Inc.», США). В результате исследований были идентифицированы SNP, ассоциированные с живой массой и локализованные вблизи генов, оказывающих прямое или косвенное влияние на живую массу [3]. В результате анализа SNP на 9 хромосоме был найден ген RIPK2, который ассоциирован с приростом мышечной массы.

Ген RIPK2 (Серин/треонинкиназа 2, взаимодействующая с рецептором RIPK2), согласно результатам исследования полногеномных ассоциаций признаков роста и мясной продуктивности овец у Li Zhang с соавторами, является геном-кандидатом, ассоциированным с среднесуточным приростом живой массы в период после отъема ягнёнка от матки, который является одним из важных признаком роста и мясной продуктивности [19].

Цель исследований – разработка тест-системы и дальнейшая апробация на результативность определения полиморфизма генотипов гена RIPK2.

Задачи исследований – теоретическое моделирование тест-системы – дизайн праймеров и зондов для таргетных SNP в гене RIPK2 на основе общепринятых правил подбора; создание тест-системы для исследования полиморфизма генотипов гена RIPK2 на полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-time PCR).

Материал и методы исследования.

Для исследования были использованы образцы биоматериалов (ушные выщипы) 148 голов овец южной мясной породы.

Образцы ткани овец были получены из биоколлекции «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» (зарегистрирован Минобрнауки РФ 498808), созданной и поддерживаемой в ФГБНУ ФИЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л. К. Эрнста.

Для проведения исследований использовали оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста.

ДНК из ткани выделяли с помощью набора ДНК-Экстран-2 (ЗАО «Синтол») по протоколу производителя.

По общепринятым правилам подбора праймеров и зондов были подобраны нуклеотидные последовательности для исследуемого гена RIPK2:

• - размер праймеров должен быть 16-25 нуклеотидов;
• - разница в температуре плавления праймеров – не более 6 градусов;
• - соотношение Ц + Г должно быть не более 50-60%;
• - для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3'-конца праймера содержали GC-основания;
• - отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимокомплиментарными);
• - отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовалось праймер-димеров);
• - область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности.

Экспериментально были подобраны составы реакционной смеси и оптимальные условия проведения ПЦР. Для двух генов реакции проводили в конечном объеме 20 мкл: 2,0 мкл реакционного буфера (10X Taq Turbo буфер, ЗАО «Евроген»), 12,0 мкл H₂O, 2,0 мкл dNTPs, 2,0 мкл смеси праймеров, 0,8 мкл смеси зондов (0,3 мкл зонда FAM и 0,5 мкл зонда R6G), 0,2 мкл SmartTaq ДНК полимеразы (ЗАО «Диалат Лтд.»), 1,0 мкл ДНК.

Амплификацию фрагмента гена RIPK2 проводили в следующем температурно-временном режиме: 5 мин при 95°С (1 цикл); 20 с при 95°С, 40 с при 60°С, 5 с при 72°С (40 циклов); заключительный этап – 1 мин при 72°С, 0 мин при 4,0°С (1 цикл).

ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием прибора QuantStudio®5 (ThermoFisher Scientific, США). Результат оценивали по многопараметрическому графику.

Результаты исследований.

Для определения полиморфизма гена RIPK2 была разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени. Подбор праймеров и зондов для амплификации фрагмента с таргетными SNP в генах RIPK2 длиной 60 пар нуклеотидных последовательностей проводились на основе референсной последовательности ДНК на 9 хромосоме (NC_056062.1), представленных в NCBI.

В таблице 1 представлены последовательности праймеров и зондов, подобранных для тест-системы определения полиморфизма гена RIPK2, ассоциированных с мясной продуктивностью овец.

 

Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов, подобранных для тест-системы определения полиморфизма гена RIPK2, ассоциированных с живой массой овец

Название гена	Последовательности праймеров и зондов (5’ – 3’)
RIPK2	Fam-5`-TCAGGTATAAGAGCCTATTGCT-3`
	Rev-5`-GGGGTCGCAGAGAGTCCAAC-3`
	5`-FAM-GTTCACTCACTAAGTTGTGTTG-BHQ-1-3`
	5`-R6G-GTTCAGTCACTAAGTTGTGTTG-BHQ-1-3`

Примечание. FAM – прямой праймер (комплементарен 3’-цепи ДНК), REV – обратный праймер (комплементарен 5’-цепи ДНК).

 

Температуры отжига праймеров и зондов были определены с помощью постановки ПЦР-градиента на приборе QuantStudio®5 (ThermoFisher Scientific, США). Для гена RIPK2 оптимальные температуры отжига составили 60°С.

В результате проведения PCR Real-time были выявлены различные аллельные варианты генов RIPK2 (рис. 1).

Как показано на рисунке 1, аллелю C в гене RIPK2 соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя FAM, аллелю G в гене RIPK2 соответствует увеличение флуоресценции по каналу красителя R6G.

 

Рис. 1. Многопараметрические графики различных аллельных вариантов гена RIPK2: а – генотип СС; б – генотип CG; в – генотип GC

 

В результате генотипирования овец по гену RIPK2 методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени были выявлены все три генотипа (G/G, С/G и С/С). В таблице 2 представлены частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену RIPK2.   

 

Таблица 2. Частота встречаемости аллелей и генотипов по гену RIPK2

Ген	Частота аллелей, %		Частота генотипов
			G/G (Т/Т)		C/G (Т/С)		С/С
	G(Т)	С	n	%	n	%	n	%
RIPK2	8,12	91,88	1	0,68	22	14,86	125	84,46

 

Анализ по гену RIPK2 выявил, что 1 особь из исследуемой выборки (0,68%) имела гомозиготный генотип G/G, гомозиготный генотип C/C найден у 125 голов (84,46%) и 22 овцы (55,11%) оказались гетерозиготами (C/G). Частота аллелей различалась значительно в исследуемой популяции (аллель G – 8,12%, аллель С – 91,88%).

Полученные результаты исследования демонстрируют производительность разработанной тест-системы и их готовность для проведения ДНК-анализов и дальнейшего внедрения в селекционный процесс хозяйств.

Данное исследование будет продолжено: будут установлены корреляции выявленных генотипов непосредственно с показателями мясной продуктивности мелкого рогатого скота, а именно на базе южной мясной породы овец.

Заключение.

В результате проведенной работы была разработана и апробирована информативная тест-система, позволяющая дифференцировать генотип в гене RIPK2. Описанная тест-система имеет перспективы для применения в селекционной работе в овцеводстве, в частности для отбора наиболее перспективных овец нового создаваемого селекционного типа. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (тема FGGN-2022-0002).

About the authors

Anastasia D. Soloveva

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L. K. Ernst

Author for correspondence.
Email: anastastasiya93@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2628-9554

Junior Research Assistant

Russian Federation, Dubrovitsy settlement, Podolsk City District, Moscow Region

Olga A. Koshkina

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L. K. Ernst

Email: olechka1808@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4830-6626

Junior Research Assistant, post-graduate student

Russian Federation, Dubrovitsy settlement, Podolsk City District, Moscow Region

References

Supplementary files