The effect of bacillus amyloliquefaciens on the body of goats

Full Text

В существующих реалиях сегодняшнего дня повышается значимость условно-патогенных энтеробактерий в развитии инфекционной патологии животных. Учитывая сложившуюся ситуацию изыскание новых средств, повышение эффективности и расширение спектра действия существующих препаратов для профилактики и лечения животных приобретает решающее значение [1, 2, 3]. Роль сельского хозяйства в развитии России и повышении благосостояния россиян неуклонно возрастает, увеличивается поголовье сельскохозяйственных животных, формируются перспективные направления развития животноводства с расширением рынка продажи готовой продукции. В связи с этим задачи по сохранению и преумножению поголовья сельскохозяйственных и промысловых животных, повышению их продуктивности, качества продукции обуславливают острую необходимость внедрения в жизнь новых препаратов различного происхождения [4, 5].

Медведева П. И. с коллегами создали пробиотический препарат на основе Bacillus Аmyloliquefaciens – уникальное действующее вещество, являющееся антагонистом патогенных микроорганизмов, таких как: Escherichia coli, Salmonella и другие. Авторы использовали пробиотический препарат препарата на основе Bacillus Аmyloliquefaciens для сельскохозяйственной птицы. Препарат показал высокую эффективность при исследованиях в опыте с концентрацией лиофилезированной массы спорообразующих бактерий Bacillus amyloliquefaciens в количестве не менее 1×107 КОЕ/г. Рекомендуется к использованию в птицеводстве с целью повышения продуктивность и качества мяса сельскохозяйственной птицы [6].

Результаты исследования Jubair Al-Rashid and his colleagues убедительно свидетельствуют о потенциале биоконтроля Bacillus amyloliquefaciens FH1-RS1 и Bacillus cereus R19, демонстрируя значительное противогрибковое действие в отношении Verticillium dahliae V991, зависящее от объема. Это явление имеет решающее значение для определения оптимальных концентраций, необходимых для достижения максимальной эффективности биоконтроля, и согласуется с другими сообщениями о дозозависимых реакциях препаратов для биоконтроля [7].

В связи с вышеизложенным, изучение применения в козоводстве пробиотика на основе B. Amyloliquefaciens для улучшения метаболизма продуктивных животных является актуальной темой.

Цель исследований ‒ определить влияние на микрофлору желудочно-кишечного тракта и продуктивность молодняка коз назначения пробиотика на основе B. Amyloliquefaciens

Задачи исследований ‒ анализ основных показателей крови козлят; выделение и идентификация микрофлоры желудочно-кишечного тракта; определение факторов патогенности и персистенции микроорганизмов при применении микробиологического препарата на основе Bacillus Amyloliquefaciens; идентификация микрофлоры желудочно-кишечного тракта козлят, выявление факторов патогенности и персистенции выявленной микрофлоры.

Материал и методы исследования. Пробиотик на основе Bacillus Amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 (В. аmyloliquefaciens) произведен в исследовательской лаборатории индивидуального предпринимателя, главы Крестьянского (Фермерского) Хозяйства «Цирулев Евгений Павлович» [8]. Препарат представляет собой жидкость светло-коричневого цвета, средняя концентрация составляет 4×10⁹ КОЕ (КОЕ – колониеобразующая единица). Препарат имеет положительное экспертное заключение по токсиколого-гигиенической оценке штамма B. amyloliquefaciens от 19.06.2023 г от Самарской испытательной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ». При проведении исследований in vitro препарат показал стойкие антагонистические способности в отношении бактериальных и грибных фитопатогенов в концентрации 4×10⁷ КОЕ [8].

Научно-производственный опыт проводили на ферме по производству и переработке козьего молока КФХ «Семкина О.В.» Приволжского района Самарской области. Козлята были подобранны по принципу пар аналогов по 10 голов в группе 2-месячного возраста. Для проведения эксперимента создали три группы животных по 10 голов в каждой [8]. В контрольную группу входили козлята, имеющие основной рацион кормления. Козлята I опытной группы принимали пробиотик в дозе 4×10⁹ , II опытной – 4×10⁷ за 30 мин до кормления по 1 капсуле на голову 1 раз в сутки в течение месяца при помощи болюсодавателя.

Суспензию биоматериала для получения роста культур бактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию биоматериала высевали на питательный агар с эозинметиленовым синим Левина, на дифференциально-диагностическую коммерческую питательную среду: лактозный агар Дригальского, на модифицированный нами лактозый агар Дригальского. Наряду с выше указанными средами, эшерихии выделяли на средах Эндо и кровяном агаре [9, 10].

Протеи выделяли на агар П-1 с полимиксином и солями желчных кислот, на скошенном МПА и кровяном МПА, клебсиеллы выделяли на агаре Плоскирёва и кровяном МПА. Сальмонеллы выделяли на висмут-сульфитном агаре и железо-сульфитном агаре, в селенитовой среде Leifson (коммерческой и модифицированной), а также в магниевой среде, тетротионатовой среде Мюллера и среде Мюллера-Кауфмана, на сальмонелла-шигелла агаре. Иерсинии выделяли на дифференциально-диагностическом СБТС-агаре и селективном CIN-агаре, на глюкозо-кровяном агаре, морганеллы – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, гафнии – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, эрвинии – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, энтеробактеры – на эозинметиленовом агаре, серрации – на пептон-глицериновом агаре, клюйверы – на глюкозо-кровяном агаре, цитробактеры – на висмут-сульфитном агаре и агаре Плоскирева, провиденции – на глюкозо-кровяном агаре, шигеллы выделяли на сальмонелла-шигелла агаре. Суспензию материала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-30℃, 37℃ 48-72 ч [6, 7]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам, а также в ходе проведения ПЦР анализа. Количество выросших колоний микроорганизмов на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий).

Определение факторов патогенности энтеробактерий проводили по общепринятым методам. Гемолитическую и желатиназную, каталазную активность культур энтеробактерий выявляли в ходе культивирования микроорганизмов на обогащённых средах и путём постановки биохимических тестов. Активность протеаз культур энтеробактерий определяли по убыли альбумина после совместной инкубации с исследуемыми микроорганизмами биуретовым методом. Определение факторов персистенции микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами. Антилизоцимную и антикарнозиновую активность определяли фотометрическим методом. Способность микроорганизмов к образованию биоплёнок выявляли по степени связывания микроорганизмами кристаллического фиолетового в полистироловых планшетах. Биохимические свойства энтеробактерий изучали постановкой пёстрого ряда со средами Гисса, в пластинах ПБДЭ (пластина для биохимической дифференциации энтеробактерий) и в других специфических тестах. Серологические свойства энтеробактерий изучали в реакциях со специфическими диагностическими сыворотками в реакциях, агглютинации, связывания комплемента, преципитации. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью специальных компьютерных программ.

Результаты исследования. Исследование выявило тенденцию к повышению основных биохимических показателей сыворотки крови у животных принимающих пробиотик В. аmyloliquefaciens в дозе 4×10⁹  и 4×10⁷, относительно контрольных данных. Все показатели находились в пределах физиологической нормы (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели крови козлят

Показатели	Группы животных
	контрольная группа	первая опытная	вторая опытная
Эритроциты, 1012/л	12,16±0,18	17,55±0,34	13,06±0,24
Гемоглобин, г/л	91,12±0,44	99,24±1,18	92,64±0,94
Лейкоциты, 109/л	10,08±0,42	12,64±0,28	10,68±0,74
Сегментоядерные нейтрофилы, 109/л	4,08±0,03	6,40±0,04	4,34±0,08
Лимфоциты, 109/л	5,72±0,06	6,22±0,03	5,34±0,10
Фагоцитарная активность нейтрофилов, %	36,22±1,08	50,46±0,26	38,86±1,56
Фагоцитарное число	1,14±0,04	2,62±0,04	1,38±0,08
Лизоцимная активность, %	34,12±0,30	43,16±0,48	35,68±0,42
Бактерицидная активность, %	44,18±0,38	52,64±1,06	45,18±0,34
Общий белок, г/л	62,28±0,70	67,06±0,86	63,08±1,46
Гамма-глобулины, г/л	7,14±0,10	8,34±0,16	7,84±0,32

 

В ходе лабораторного микробиологического исследования зафиксировано наличие в желудочно-кишечном тракте козлят облигатных и временных представителей микробного мира. В образцах, отобранных от опытных козлят, идентифицировано повышение количества микробных ассоциаций, состоящих из энтерококков, бифидобактерий и лактобацилл. У козлят с дисфункцией желудочно-кишечного тракта в начале исследования превалировали патогенные штаммы Escherichia coli, что сопровождалось существенным снижением концентрации облигатных микроассоциаций. Затем по достижению трехмесячного возраста произошла коррекция микробиоты желудочно-кишечного тракта (табл. 2).

 

Таблица 2. Микрофлора желудочно-кишечного тракта козлят

Показатели	Период исследования, возраст животных (дни)
	Контрольная группа	Первая опытная	Вторая опытная
Enterococcus faecium	3,52×108±0,22	6,52×108±0,12	4,33×108±0,54
Enterococcus faecalis	4,08×108±0,08	6,58×108±0,20	4,76×108±0,14
Enterococcus flavescens	1,06×108±0,04	2,46×108±0,08	1,30×108±0,06
Bacteroides fragilis	4,26×106±0,16	3,14×106±0,08	4,08×106±0,46
Bifidobacterium bifidum	3,92×1010±0,70	8,40×1010±0,78	4,84×1010±0,84
Bifidobacterium thermophilum	4,06×1010±0,38	8,18×1010±0,96	4,62×1010±0,74
Lactobacillus delbrueckii	4,12×1010±0,54	7,54×1010±0,48	4,38×1010±0,46
Lactobacillus acidofilus	4,20×1010±0,33	7,38×1010±0,74	4,62×1010±0,28
Micrococcus luteus	4,63×104±0,06	4,26×104±0,08	4,08×104±0,14
Escherichia coli	7,32×106±0,42	5,16×106±0,14	6,88×106±0,72
Serratia marcescens	4,92×104±0,54	4,42×104±0,34	4,56×104±0,66

 

В ходе исследования биохимических и серологических свойств у культур энтерококков желатиназная и гемолитическая активность не выявлена. Это свидетельствует об отсутствии данных факторов патогенности (вирулентности) у выделенных энтерококков. Высокая активность протеолитических ферментов у представителей рода Enterococcus является важнейшим инструментом антагонистической способности по отношению к патогенным микроорганизмам. Все выделенные и идентифицированные культуры энтерококков обладали протеолитической активностью (табл. 3). У козлят контрольной группы протеолитическая активность энтерококков была более выражена, чем у энтерококков козлят опытной группы.

 

Таблица 3. Протеолитическая активность культур энтерококков у козлят

Культура Enterococcus sp.	Протеолитическая активность мг∙мл/мин
	Контрольная группа	Первая опытная	Вторая опытная
Enterococcus faecium	1,42±0,008	0,66±0,004	0,60±0,003
Enterococcus hirae	1,14±0,006	0,52±0,006	0,55±0,004
Enterococcusfaecalis	1,72±0,009	0,64±0,003	0,66±0,005
Enterococcus flavescens	1,34±0,007	0,58±0,006	0,62±0,002
Enterococcus casseliflavus	1,68±0,006	0,46±0,008	0,54±0,002

 

Основными показателями, определяющими персистентные свойства микроорганизмов, являются антилизоцимная активность, антикарнозиновая активность и способность к образованию биоплёнок. Среди факторов персистенции антилизоцимная и антикарнозиновая активность выявлены нами в контрольной группе животных у Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis, Escherichia coli и у культур энтерококков.

Бактерии Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis, Escherichia coli проявили наиболее высокие показатели антилизоцимной активности. В результате исследования антилизоцимной активности у представителей рода Enterococcus было выявлено, что данный признак встречался у 100% изолятов выделенных нами от козлят. Среди энтерококков уровень проявления антилизоцимной активности был более высоким у изолятов Enterococcus hirae, а наименьшим у изолятов Enterococcus casseliflavus. При этом у козлят контрольной группы антилизоцимная активность энтерококков и Escherichia coli была меньше по сравнению с аналогичными микроорганизмами у козлят опытной группы.

Выживание условно-патогенных бактерий реализуется через их способность к адаптации и инактивации защитных свойств макроорганизма. Дипептид природного происхождения карнозин (β-аланил L-гистидин) является одним из основных факторов неспецифической реактивности организма человека и животных. Все изоляты Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, энтерококков, выделенные нами от козлят, обладали антикарнозиновой активностью. Бактерии Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis показали относительно невысокие значения антикарнозиновой активности по сравнению с Escherichia coli и энтерококками. Изоляты Escherichia coli проявили достаточно высокую антикарнозиновую активность у животных контрольной и опытных групп. Среди энтерококкков уровень проявления антикарнозиновой активности был более высоким у изолятов Enterococcus hirae, а наименьшим у изолятов Enterococcus casseliflavus. При этом антикарнозиновая активность энтерококков у козлят контрольной группы была менее выраженной по сравнению с энтерококками козлят опытной группы.

Микроассоциации, состоящие из облигатных энтерококков, бифидобактерий и лактобацилл формировали так называемые функциональные биопленки на слизистой желудочно-кишечного тракта животных с самого рождения. Этот процесс завершается у козлят к месячному возрасту. У животных опытных групп, судя по специфическим показателям, биопленкообразования складывались быстрее, чем у животных контрольной группы. Назначение пробиотика на основе B. amyloliquefaciens в дозе 4×10⁹  и 4×10⁷ КОЕ козлятам ежедневно положительно повлияло на микробиоту животных.

Наряду с этим, величины показателей биопленкообразования у бифидобактерий и лактобацилл были наиболее высокими. Менее выражена была способность образовывать биопленки у бактероидов, серраций, эшерихий и других энтеробактерий.

Заключение. У козлят трехмесячного возраста, находящихся в одинаковых условиях содержания в хозяйстве и получающих основной рацион кормления, организм развивался стабильно и изученные параметры жизнедеятельности находились в пределах физиологически обусловленных рамок. Добавление же к основному рациону пробиотика на основе Bacillus. amyloliquefaciens позволило активизировать метаболических реакций в организме за счет жизнедеятельности полезной микрофлоры. Использование пробиотика способствовало более быстрому восстановлению жизненно необходимой микрофлоры, что обеспечило нивелирование действия и вытеснение патогенных штаммов Escherichia coli из организма животных.

 

Благодарности: Работа выполенена в рамках научного проекта: «Разработка и внедрение в промышленное производство Самарской области способа повышения адаптационных и продуктивных показателей мелкого рогатого скота назначением отечественного биопрепарата» № 23-26-10009.

Acknowledgements: The work was carried out within the framework of the scientific project: «Development and introduction into industrial production of the Samara region of a method for increasing the adaptive and productive indicators of small cattle by prescribing a domestic biological product» № 23-26-10009.

Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Contribution of the authors: all authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.

About the authors

Galina V. Molyanova

Samara State Agrarian University

Author for correspondence.
Email: molyanova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1325-6809

Doctor of Biological Sciences, Professor

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara Region

Vladimir V. Ermakov

Samara State Agrarian University

Email: vladimir_21_2010@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6683-0512

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara Region

Oksana V. Stmkina

Samara State Agrarian University

Email: oks3350@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7542-1198

graduate student

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara Region

Alisa P. Vinokurova

Samara State Agrarian University

Email: jaskiermirror@gmail.com
ORCID iD: 0009-0000-2132-0933

member of the scientific team

Russian Federation, Ust-Kinelsky, Samara Region

References

Supplementary files