Calpastatin gene polymorphism analysis (cast) in sheep of southern meat breed

Full Text

Одним из приоритетных направлений в животноводстве, в том числе и овцеводстве, способствующих интенсивному развитию отрасли, является активное внедрение современных методов молекулярно-генетической диагностики, которая позволяет определить и установить желательные генотипы в генах-кандидатах, ассоциированных с хозяйственно – полезными признаками.

Известно, что качество мяса во многом зависит от нежности, цвета, количества соединительной ткани, расщепления миофибриллярного белка и содержания внутримышечного жира. Нежность мяса во многом определяется генетическими факторами самого животного. Одним из генетических компонентов, влияющих на нежность мяса, является ген кальпастатина [1].

Кальпастатин – это регуляторный белок, высокоспецифичный эндогенный ингибитор μ- и m-кальпаинов (кальций-зависимой нейтральной протеиназы), который не оказывает влияния на другие протеазы (папаин, катепсины B и D, бромелайн, трипсин, химотрипсин, пепсин, плазмин и др.). Этот ингибитор кальпаинов был впервые обнаружен в соединительных тканях. Название "кальпастатин" было впервые предложено в 1979 году Такаши Мурачи [2, 3]. Определение полиморфизма гена кальпастатина в мясном овцеводстве является решающим фактором среди молекулярно-генетических маркеров [4].

Система кальпаин-кальпастатин включает m-кальпаин (CAPN1), µ-кальпаин (CAPN2) и кальпастатин и играет ключевую роль в развитии скелетных мышц, участвует в миграции миобластов, белковом метаболизме, апоптозе, росте и развитии мышц, а также в отложении жира [5]. Ген кальпастатина ингибирует активность кальпаина и важен для регулирования нежности мяса после забоя, веса при рождении и скорости роста до отъема. У овец существует обратная зависимость между уровнем кальпастатина в мышцах после забоя и нежностью мяса. Ген CAST оказывает значительное влияние на массу тела при рождении и толщину жира [6].

В базе Национального центра биотехнологической информации NCBI указано, что ген CAST расположен в локусе 5q15 хромосомы 5 (NC_040256.1) генома овцы (Ovis aries L.), состоящего из 29 экзонов. Первая идентификация гена кальпастатина у овец была проведена Палмером и со авторами [7] с использованием метода ПЦР-RFLP. Полиморфизм был обнаружен в амплифицированном фрагменте длиной 622 п.н. из экзона и интрона 1 гена CAST с помощью эндонуклеазы MspI, которая расщепляет нуклеотидную последовательность в следующем специфическом участке: 5'...C↓CGG...3'. Таким образом, были идентифицированы два полиморфных варианта, которые появляются в результате наличия или отсутствия точечной мутации (SNP) и изменения CCGG на CCAG [5, 8].

Многие авторы проводили ассоциативные исследования гена CAST с хозяйственно-полезными признаками у различных пород овец. Пакистанские породы овец Балхи и Каджли с гетерозиготным (MN) генотипом по этому гену демонстрировали более высокий прирост в весе от рождения до четырехмесячного и восьмимесячного возраста [9]. У приднепровской породы наблюдается тенденция к увеличению живой массы ягнят-носителей аллеля N в возрасте 90 дней (NN или MN) [10]. У овец иорданской породы Аваси с генотипом MN отмечалось более длинная длиннейшая мышца, более высокий суточный прирост при низком коэффициенте конверсии и большей мышечной массой по сравнению с животными, у которых был генотип ММ, но нежность мяса у животных с генотипом MN была ниже, чем у животных с генотипом ММ [11]. Овцы западно-сибирской мясной породы с генотипом MN также отличались лучшим среднесуточным приростом массы тела от рождения до отъема на 6,9% и живой массой на 20% по сравнению с овцами с генотипом NN [12]. У овец ставропольской породы с генотипом NN был отмечен достоверно более высокий уровень (на 43,4% при Р˂0,01) метаболической активности липидов мышечной ткани по сравнению с носителями генотипа MM [13].

Установление генетического полиморфизма у существующих пород овец является важной задачей, с одной стороны, для местных пород с целью сохранения генетических ресурсов, а с другой стороны, для эффективного использования существующих пород. В Российской Федерации существуют различные породы овец, включая местные породы и другие, предназначенные для конкретных целей, таких как производство молока, мяса и шерсти.

Цель исследований: анализ полиморфизма гена кальпастатина (CAST) у овец южной мясной породы.

Задачи исследования: оценить генетический полиморфизм у групп овец южной мясной породы по гену кальпастатин (CAST).

Материал и методы исследования. Исследования проводились на образцах ткани (ушной выщип) генофондных овец южной мясной породы в количестве 154 голов, которые в свою очередь состояли из трех групп: генофондных баранов (n=80), генофондных баранчиков (n=23) и генофондных ярочек (n=51).

Образцы ткани были взяты из биоколлекции «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» (зарегистрирован Минобрнауки РФ № 498808), созданной и поддерживаемой в ФГБНУ ФИЦ животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.

При выполнении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им Л.К. Эрнста.

Из выбранных образцов была выделена ДНК с помощью коммерческого набора «ДНК-Экстран-2» (ООО «Синтол», Россия) по стандартному протоколу производителя. Полимеразная цепная реакция проводилась в конечном объеме 15 мкл: 1,5 мкл реакционного буфера с MgCl2, 1,5 мкл dNTPs, 0,4 мкл смеси праймеров, 0,08 мкл SmartTaq ДНК полимеразы («Диалат Лтд.», Россия), 1 мкл ДНК. Амплификацию проводили в следующем температурно-временном режиме: 4 мин при 95°С (1цикл); 45 с при 94°С, 45 с при 62°С и 45 с при 72°С (35 циклов); заключительный этап - 7 мин при 72°С (1цикл) (термоциклер Applied Biosystems SimpliAmp («Thermo-Fisher Scientific, Inc.», США). Рестрикция проводилась в конечном объеме 20 мкл: 7,5 мкл H2O, 2 мкл Buffer Rose, 0,5 мкл эндонуклеаза рестрикции MspI (ООО «SibEnzyme»), 10 мкл амплифицированного ПЦР-продукта. Реакцию проводили в термостате при 37°С.

Анализ полиморфизма гена кальпастатина овец (CAST) проводили с помощью метода ПЦР-ПДРФ с последующим разделением рестрицированных фрагментов в 2%-м агарозном геле, окрашенном бромидом димидиума, для идентификации генотипа.

Результаты исследований. В рамках исследования полиморфизма ДНК-маркеров овец было выполнено тестирование овец южной мясной породы по гену кальпастатин (CAST). Для выявления аллельных вариантов в гене CAST был проведен анализ у 154 голов овец южной мясной породы. При проведении молекулярного анализа овец южной мясной породы были выявлены все аллельные варианты CAST^MM, CAST^MN, CAST^NN которые приведены на рисунке 1.

 

Рис. 1. Электрофорез рестрикционного ПЦР- продукта гена CAST с использованием рестрикционного фермента MspI на 2% агарозном геле у овец южной мясной породы (генотипы NN – 622 п.о, MM – 286 и 336 п.о, MN – 286, 336 и 622 п.о.)

 

Мутация гена CAST 287A>C определяет полиморфизм гена. Три генотипа: NN (622bp), MM (336bp и 286bp), и MN (622bp, 336bp и 286bp) были идентифицированы после реакции рестрикции с использованием рестрикционного фермента MspI.

Результаты анализа частот встречаемости аллелей и генотипов гена кальпастатин (CAST) в популяции овец южной мясной породы приведены в таблице 1.

В таблице 2 приведены данные анализа частот по группам животных.

 

Таблица 1

Частота встречаемости аллелей и генотипов гена CAST у исследованной выборке овец южной мясной породы

Ген	Частота аллелей, %		Частота встречаемости генотипов, %
CAST (n=154)	M	N	MM		MN		NN
	%	%	n	%	n	%	n	%
	0,92	0,08	129	83,8	23	15	2	1,29

 

Таблица 2

Частота встречаемости аллелей по группам животных

Группа овец	Количество овец	Частота аллелей, %		Частота встречаемости генотипов, %
		M	N	MM		MN		NN
		%	%	n	%	n	%	n	%
Бараны	80	0,93	0,07	70	87,5	8	10	2	2,5
Баранчики	23	0,91	0,09	19	82,60	4	17,39	-	-
Ярочки	51	0,89	0,11	40	78,43	11	21,56	-	-

 

Исследование выбранных групп овец южной мясной породы по данным полиморфизма гена CAST показали наличие всех трех генотипов CAST^MM, CAST^MN и CAST^NN. В результате анализа было выявлено, что ген кальпастатин (CAST) является полиморфным в изучаемой выборке овец. Наибольшей частотой встречаемости характеризовался аллель M (0,92), который встречался в гомозиготном состоянии у 129 (83,8%) особей и в гетерозиготном – у 23 (15%) овец. Частота встречаемости аллеля N и генотипа NN составили 0,08 и 1,29% соответственно. По таблице 2 можно увидеть, что генотип NN встречается только у группы баранов, когда как у группы баранчиков и ярочек данного генотипа не обнаружено. Так же стоить отметить, что аллель М и генотип ММ преобладает у всех трех исследуемых групп животных.

Заключение. Полученные впервые результаты анализа полиморфизма гена кальпастатин (CAST) у овец южной мясной породы свидетельствуют о наличия разнообразия аллельных вариантов. При изучении полиморфизма гена CAST овец у южной мясной породы были обнаружены генотипы ММ и MN с различной частотой встречаемости. Результаты этой работы, а именно: наличие полиморфизма в таргетном однонуклеотидном полиморфизме в гене CAST у овец южной мясной породы, создают предпосылки для внедрения этого ДНК-маркера в селекционную работу с южной мясной породой овец.

 

Благодарности: Работа проведена в рамках выполнения задания Министерства науки и высшего образования РФ по теме FGGN-2024-0015.

Acknowledgements: The work was carried out within the framework of the assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation on the topic AP-2024-0015.

About the authors

Anastasia D. Solovyova

Federal Research Center of Animal Husbandry – Academician L. K. Ernst VIZ.

Author for correspondence.
Email: anastastasiya93@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2628-9554

Junior Researcher

Russian Federation, Dubrovitsy, Podolsk, Moscow region

Tatyana E. Deniskova

Federal Research Center of Animal Husbandry – Academician L. K. Ernst VIZ.

Email: horarka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5809-1262

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, leading researcher

Russian Federation, Dubrovitsy, Podolsk, Moscow region

References

Supplementary files