POLIMORFIZMY GENOV SOMATOTROPINOVOGO KASKADA, ASSOTsIIROVANNYE S MYaSNOY PRODUKTIVNOST'Yu KOROV KAZAKhSKOY BELOGOLOVOY PORODY

Full Text

Оценка животных по генетическим маркерам является более эффективной, если включены гены одного физиологического пути, так как в таком случае экспрессия одного гена влияет на экспрессию всех остальных. Следовательно, при анализе комплексного влияния полиморфизмов на исследуемые признаки обнаруживаются парные сочетания с потенцирующим действием [1]. Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (bPit-1, bGH, bGHR, bIGF-1) [2, 3]. Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота [4, 5]. Характеристика соматотропинового каскада. Известно, что гормон роста и целый ряд других белков (прямо или косвенно необходимых для его функционирования) обеспечивают разнообразные молекулярные и клеточные эффекты, приводящие, в конечном счёте, к развитию и росту организма [6]. Эти белки составляют своеобразную ось («axis») или систему, которая запускает и контролирует совокупность метаболических процессов, ведущих к росту и связанных с клеточной дифференцировкой [2]. Функционирование системы гормона роста представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки других белков/пептидов. Компоненты этой системы участвуют в запуске секреции гормона роста, его транспорте в кровотоке, в передаче гормонального сигнала в клетке-мишени (внутриклеточный сигналинг) и, наконец, в целенаправленных изменениях генной экспрессии в клетках-мишенях [6]. В целом, в системе гормона роста выделяют две ветви - «основную» и «боковую» или «дополнительную», а также три специальных регуляторных звена, обусловленных действием: соматолиберина (гипоталамический релизинг-фактор гормона роста или соматокрин, GHRH); соматостатина (SST, SRIF); грелина («ghrelin», GHRL). Каждое из этих регуляторных звеньев представляет собой целую цепь молекулярных событий, влияющих на секрецию гормона роста. Центральной фигурой в системе ГР/ИФР, естественно, считают сам гормон роста, который продуцируют высокодифференцированные соматотрофные клетки гипофиза. Синтез ГР обеспечивает ген bGH. Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок - рецептор, тесно связанных между собой. Нарушение, и, тем более, выпадение любого звена влечет за собой изменения в работе соматотропиновой оси, которые могут привести как к различиям в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных, так и к заболеваниям, развивающимся на разных этапах онтогенеза [7]. Цель исследований - установление ассоциации генотипов полиморфизмов bPit-1-HinfI, bGH-AluI и bGHR-SspI с мясной продуктивностью казахского белоголового скота, перспективных в использовании в качестве генетических маркеров хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота. Задачи исследований: - провести генотипирование крупного рогатого скота по генам соматотропного каскада; - изучить влияние генотипов исследуемых генов на показатели мясной продуктивности коров. Материалы и методы исследований. Объект исследования - выборки коров казахской белоголовой породы. Предмет исследования - полиморфные гены соматотропинового каскада (bPit-1, bGH, bGHR и bIGF-1). Материал исследования - образцы ДНК, выделенной из крови коров казахской белоголовой породы. Определение генотипов животных осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ. Последовательности праймеров и условия ПЦР для анализа каждого полиморфизма приведены в таблице 1. Таблица 1 Индивидуальные характеристики условий ПЦР для исследуемых полиморфных локусов генов соматотропинового каскада Полиморфизм Условия амплификации Последовательности праймеров bPit-1-HinfI 95° - 5 мин; (95° С - 45 c; 55,3°С - 45 c; 72°С - 45 c) х х 34 цикла; 72°С - 10 мин; 12°С - 10 мин HinFI-F: 5′-aaaccatcatctcccttctt-3′ HinFI-R: 5′-aatgtacaatgtcttctgag-3′ bGH-AluI 95°С - 5 мин; (95°С - 30 c; 64°С - 30 c; 72°С - 60 c) х х 35 циклов; 72°С - 10 мин AluI-F: 5′-ccgtgtctatgagaagc-3′ AluI-R: 5′'-gttcttgagcagcgcgt-3′ bGHR-SspI 95°С - 3 мин; (95°С - 30 c; 62°С - 30 c; 72°С - 30 c) х х 30 циклов; 72°С - 10 мин; 12°С - 5 мин SspI-F: 5′-aatatgtagcagtgacaatat-3′ SspI-R: 5′-acgtttcactgggttgatga-3′ bIGF-1-SnaBI 95°С - 3 мин; (95°С - 30 c; 64°С - 30 c; 72°С - 30 c) х х 35 циклов; 72°С -10 мин; 12°С - 5 мин SnaBI-F: 5′-attcaaagctgcctgcccc-3′ SnaBI-R: 5′-acacgtatgaaaggaact-3′ Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов включал обработку амплификата сайт-специфической рестриктазой и последующее разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза. Использовали маркер молекулярных масс O’RangeRulerTM 50 bpDNALadder (Thermo Fisher Scientific, Литва). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле (SeaKem LE Agarose, Lonza, США). Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit-1 в экзоне 6 проводился с помощью рестриктазы HinfI. Полиморфизм обусловлен A→G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinfI является последовательность G↓ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А, соответствующий аллелю bPit-1-HinfIВ [8]. В случае присутствия G-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit-1-HinfIA. Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGH в экзоне 5 проводился с помощью рестриктазы AluI. Полиморфизм обусловлен транзицией C→G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности аминокислот белка. Сайтом узнавания для рестриктазы AluI является последовательность АG↓CТ. Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH-AluIL. В случае присутствия G-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH-AluIV. Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в экзоне 8 проводился с помощью рестриктазы SspI. Рестриктаза SspI распознает Т→А транзицию в экзоне 8. Данная замена вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного, остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении 279 белка. Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТ↓АТТ. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т, соответствующий аллелю bGHR-SspIF. В случае присутствия A-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGHR-SspIY. Полиморфизм нуклеотидной последовательности гена инсулиноподобного фактора роста-1 bIGF-1 в области Р1 промоторного региона идентифицирован как Т→С трансверсия. Эта замена распознается рестриктазой SnaBI. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т, соответствующий аллелю bIGF-1-SnaBIА. В случае присутствия С-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bIGF-1-SnaBIВ [9]. Определение предпочтительного и нежелательного аллелей проводилась путем сравнения показателей живой массы у телок с разными генотипами при рождении, а также в возрасте 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяца. Также в возрастах 12, 18 и 24 месяца была исследована ассоциация генотипов с индексами телосложения, которые характеризуют мясную продуктивность животных: сбитость, костистость, растянутость и массивность, и репродуктивную функцию животных: шилозадость. Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inс. 1994-2001), при этом использованы модули Basic Statistic/tables, Nonparametric Statistics. Сравнение выборок по распределению частот аллелей исследуемых генов, а также оценку соответствия фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга проводили с помощью критерия χ2. Различия во всех случаях рассматривались как статистически достоверные при уровне значимости Р <0,05. Так как характер распределения анализируемых признаков в исследованных группах не имел приближенно нормального распределения, и число выявленных животных с редкими генотипами в некоторых случаях было меньше 20, то в дальнейшем вся обработка и интерпретация данных, а также предоставление результатов проводилась методами непараметрической статистики. Данные представлены в виде Ме (25%; 75%), где Ме - медиана (срединное значение) признака; 25% и 75% - интерквартильный размах признака, характеризующий разброс распределения признака. Результаты исследований. Из данных, полученных в результате изучения характеристик продуктивности казахской белоголовой породы с разными генотипами полиморфизма bPit-1-HinFI (Ме (25%; 75%)) можно отметить, что как в основной, так и в контрольной группах нет достоверных различий между генотипами bPit-1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ. В качестве тенденции можно отметить, что, начиная с возраста 6 месяцев и в возрасте 9, и 18 месяцев группа животных с генотипом bPit-1-HinFIВВ характеризуется более высоким показателем живого веса по сравнению с группами с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ. Однако, низкая частота встречаемости данного генотипа в выборке казахской белоголовой породы не позволяет оценить достоверность наблюдения. По данным сравнительного анализа групп с генотипами bPit-1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ по индексам телосложения можно отметить, что в основной группе наблюдается статистически значимое превышение показателя растянутости в возрасте 24 месяца у коров с генотипом bPit-1-HinFIАА по сравнению с животными с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ. Так индекс растянутости у коров с генотипом bPit-1-HinFIАА составляет 132,768 (126,667; 137,500), в то время, как данный показатель у коров с генотипами bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFIВВ составляет 127,966 (120,833; 137,705) и 119,643 (117,544; 124,074) соответственно. То есть генотипом с наименьшим значением индекса растянутости является гомозигота bPit-1-HinFIВВ. Таким образом по признаку растянутости в возрасте 24 месяца генотип bPit-1-HinFIАА можно рассматривать как потенциальный генетический маркер. По результатам оценки ассоциации генотипа с мясной продуктивностью по полиморфизму bGH-AluI можно отметить, что в основной группе животных начиная с возраста 9 месяцев группа коров с генотипом bGH-AluILL превышает по живому весу группу коров с генотипом bGH-AluILV. В возрасте 24 месяца этот показатель различается у групп статистически значимо, что делает возможным рассматривать генотип bGH-AluILL как предпочтительный, а генотип bGH-AluILV, как альтернативный. Группа коров с генотипом bGH-AluIVV составляла всего 5 животных, поэтому не была включена в обработку. В контрольной группе наблюдается противоположная тенденция, однако небольшое число наблюдений не позволяет сделать однозначных выводов. По результатам анализа индексов телосложения у групп коров с генотипами bGH-AluILL, bGH-AluILV и bGH-AluIVV можно отметить, что в основной группе прослеживается тенденция к снижению индекса шилозадости и повышению индекса массивности у коров с генотипом bGH-AluILL по сравнению с коровами с генотипом bGH-AluILV. Это характеризует данную группу как более мясную с улучшенной репродуктивной функцией. Эти данные консолидированы с контрольной группой. Однако результаты статистической обработки не подтверждают значимости сделанных наблюдений. Анализ данных характеристик продуктивности в основной и контрольной группах коров с разными генотипами полиморфизма bGHR-SspI казахской белоголовой породы (Ме, (25%; 75%)) показал, что в основной группе в пределах полиморфизма bGHR-SspI между животными с генотипами bGHR-SspIFF, bGHR-SspIFY и bGHR-SspIYY достоверных различий в показателях живого веса не наблюдается. Такая же картина отмечается и в контрольной группе. В виде тенденции можно отметить, что гомозиготы по редкому аллелю bGHR-SspIYY характеризуются сниженным весом по сравнению с гомозиготами по более распространенному аллелю bGHR-SspIFF. Такая же тенденция прослеживается в контрольной группе. Однако, число животных в группах не позволяет провести оценку достоверности наблюдаемых различий. По результатам характеристик продуктивности основной и контрольной групп по индексам телосложения можно добавить, что животные основной группы с генотипом bGHR-SspIYY характеризуются сниженным индексом костистости в возрасте 24 месяца, а также сниженным индексом растянутости и массивности в возрасте 18 и 24 месяца. Так же для этой группы животных наблюдается снижение индекса шилозадости в возрасте 12, 18 и 24 месяца по сравнению с коровами с генотипом bGHR-SspIFF и bGHR-SspIFY. В контрольной группе у животных с генотипом bGHR-SspIYY индекс шилозадости также снижен по сравнению с коровами с генотипом bGHR-SspIFY и bGHR-SspIFF. По результатам оценки мясной продуктивности в группах коров с генотипами bIGF-1-SnaBIAA, bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIBB по полиморфизму SnaBI гена инсулиноподобного фактора роста 1 демонстрируются статистически значимые различия по признаку живой массы в возрасте 12, 18 и 24 месяца между животными с генотипами bIGF-1-SnaBIAA, bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIBB. Предпочтительными генотипами по полиморфизму bIGF-1-SnaBI являются генотипы bIGF-1-SnaBIAA и bIGF-1-SnaBIAB. Генотип bIGF-1-SnaBIBB у коров казахской белоголовой породы является альтернативным и характеризуется сниженной живой массой коров в возрасте 12, 18 и 24 месяца. По оценке индексов телосложения, можно отметить, что в основной группе животные с генотипом bIGF-1-SnaBIAA характеризуются более низкими значениями индексов растянутости и массивности в возрасте 18 и 24 месяца, что свидетельствует в пользу более низкой мясной продуктивности при одинаковой живой массе с другими группами. В то же время, эти животные характеризуются более низким индексом шилозадости, что в свою очередь является преимуществом для реализации репродуктивной функции у коров. В контрольной группе четких тенденций не прослеживается, что объясняется маленьким количеством животных. Заключение. Таким образом для коров казахской белоголовой породы установлено следующее: - полиморфизм bPit-1-HinFI ассоциирован с признаком растянутости в возрасте 24 месяца (наибольшее значение признака - генотип bPit-1-HinFIAA); - полиморфизм bIGF-1-SnaBI ассоциирован с признаком живой массы в возрасте 12, 18, 24 месяца (наибольшее значение - генотип bIGF-1-SnaBIAB и bIGF-1-SnaBIAА, наименьшее - генотип bIGF-1-SnaBIBB); - генотипы с наибольшим значением признака рассматриваются как предпочтительные, потенциальные генетические маркеры, и для оценки целесообразности включения их в селекционные программы данные групп животных сравнивали с продуктивностью общей выборки, чтобы установить характер и степень ассоциации генотипа с признаком. Исключение составляет признак шилозадости. В этом случае повышение индекса сопровождается осложнениями при первом отеле. Предпочтительным в селекционных мероприятиях считается генотип с наименьшим значением признака.

About the authors

Indira Saltanovna Beyshova

Email: indira_bei@mail.ru

References

Supplementary files