Активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах крупного рогатого скота при криоповреждении

Полный текст

Криоконсервация спермы крупного рогатого скота является важным методом сохранения и эффективного использования генетического материала от высокоценных производителей. Несмотря на большое разнообразие криопротекторов, эффективность криоконсервации спермы быков ограничена. Снижение оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы может быть связано с изменением структуры плазматической мембраны, нарушением липидного профиля в мембране сперматозоидов. Высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот в мембране спермиев объясняет восприимчивость половых клеток к оксидативному стрессу [1, 2].

В биотехнике воспроизводства для оценки репродуктивной функции используется анализ спермы, включающий определение подвижности, морфологии, концентрации сперматозоидов, что являются лишь косвенным показателем качества спермы.

Оценка активности антиоксидантных ферментов позволит провести анализ метаболических характеристик сперматозоидов при криоконсервации. В частности, криоконсервация усиливает выработку активных форм кислорода, обладающих выраженной реакционной способностью. Низкие уровни активных форм кислорода, продуцируемые сперматозоидами, участвуют в обеспечении оплодотворяющей способности. Избыточное образование активных форм кислорода может приводить к повреждению сперматозоидов. Образующиеся активные формы кислорода атакуют жизненноважные биомолекулы, изменяя работу ферментативных систем, белков, ДНК и различных мембранных структур клетки [3-5].

Сперматозоиды в норме содержат антиоксиданты, которые защищают половые клетки от повреждающего действия активных форм кислорода. Ферменты – супероксиддисмутаза и каталаза образуют антиоксидантную пару, которая борется со свободными радикалами кислорода, не давая им возможности запустить процессы свободнорадикального окисления [6, 7]. Супероксиддисмутаза – фермент, катализирующий дисмутацию супероксидного радикала до перекиси водорода и молекулярного кислорода тем самым предотвращая повреждение полиненасыщенных жирных кислот мембраны сперматозоидов, стабилизируя текучесть мембраны и восстанавливая подвижность половых клеток. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода до воды и молекулярного кислорода [6, 8].

Цель исследований – оценка активности ферментативных антиоксидантов сперматозоидов быков после оттаивания, для понимания молекулярных механизмов снижения оплодотворяющей способности спермы в процессе криоконсервации и оттаивания.

Задачи исследований – определить содержание малонового диальдегида как показателя, отражающего интенсивность протекания свободнорадикальных процессов и активность ферментов антиоксидантов – супероксиддисмутазы и каталазы в сперматозоидах крупного рогатого скота.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований служила спермопродукция чёрно-пёстрых голштинизированных быков в возрасте 3 лет. Было использовано около 100 эякулятов быков. Сбор спермы проводили в соответствии с Национальной технологией замораживания и использования спермы племенных быков-производителей [9]. Использовали свежеполученное семя с подвижностью сперматозоидов более 7 баллов, минимальным количеством аномальных форм клеток.

Сперму разбавляли стерильной средой «BioXcell» (Франция). Один и тот же эякулят подвергался двум обработкам: свежий – оценивался сразу после добавления разбавителя при температуре 37°C и размороженный – оценивался после размораживания через 60 и 120 минут. В группе с размороженным эякулятом перед началом исследований соломины со спермой (0,25 мл) размораживали на водяной бане в течение 1 мин. Освобождение сперматозоидов от семенной плазмы осуществляли путём отмывания физраствором.

Криоконсервацию спермы проводили путам смешивания с разбавителем в отношении 1:1 при 27°С, далее образцы охлаждали до 18-22°С, затем производили окончательное разбавление, фасовку и эквилибрацию (выдержка при 4°С в течение 3-4 часов). Потом проводили охлаждение спермы в течение 7,5 минут до температуры -145°С, для длительного хранения контейнер с образцами помещали в жидкий азот, при температуре -196°С.

В сперматозоидах определяли интенсивность протекания свободнорадикальных процессов путем определения в клетках концентрации малонового диальдегида (МДА) (Владимиров, Арчаков, 1972) [1].

Для исследования активности в сперматозоидах антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы и каталазы были использованы стандартные методики (Сирота, 2016) [11], (Рецкий, 2010) [12].

Математическая и статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета программ Statistic 10,0 и Microsoft Excel 2000. В случае распределения близкого к нормальному количественные показатели представлялись в виде средних значений ± стандартная ошибка средней величины. Уровень значимости (Р) был принят равным или меньшим 0,05. Поиск межгрупповых различий проводили методом сравнения средних значений по критерию Стъюдента для выборочных средних значений.

Результаты исследований. Одним из информативных маркеров окислительного стресса в биологических субстратах считается малоновый диальдегид, который является одним из конечных продуктов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот в клетке [13, 14].

 

Таблица

Влияние криоконсервации на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах быков

Показатели свободнорадикального окисления	Исходно	После размораживания через 60 мин	После размораживания через 120 мин
МДА (нМоль/мл)	0,61±0,32	0,85±0,14 *	0,74±0,28 *
СОД, ед.акт./мг белка	0,61±0,08	0,78±0,09 *	0,72±0,12 *
Каталаза, мкат/мг	9,03±0,76	8,48±0,82	8,59±0,91

Примечание: «*» – статистически значимые различия по отношению к сперматозоидам до криоконсервации, р≤0,05

 

Данные, полученные в нашем эксперименте, свидетельствуют о том, что после криоконсервации на протяжении всего эксперимента отмечалось повышение уровня малонового диальдегида относительно интактных сперматозоидов, что указывает на активизацию свободнорадикальных процессов в клетках (табл.). Через час уровень МДА был повышен на 30%, через два часа на 21%.

Считается, что основным негативным эффектом окислительного стресса в сперматозоидах является перекисное окисление липидов (ПОЛ). ПОЛ вызывает угнетение синтеза макроэргов, что, в свою очередь, приводит к снижению подвижности сперматозоидов [15-17]. В результате совокупности повреждений, вызванных окислительным стрессом, часть клеток сперматозоидов подвергается апоптозу, и они теряют подвижность. Более того, даже после оплодотворения эмбрионы, полученные от самцов с высоким уровнем окислительного стресса в семенной жидкости, имеют более высокую вероятность выкидыша из-за повреждения ДНК и окислительной модификации белков [18, 19].

Результаты по оценке активности ферментов антиоксидантной защиты в сперматозоидах быков, полученные в наших экспериментах представлены в таблице. Анализ полученных данных показал, повышение активности супероксиддисмутазы в сперматозоидах после криоконсервации на 28% и 18% через 60 и 120 минут соответственно. Вероятно, отмеченный эффект является компенсаторной реакцией на усиление процессов перекисного окисления липидов в клетках, поскольку этот фермент первым вступает в процесс антиоксидантной защиты (табл.). Активность каталазы после криоконсервации спермы не отличалась от показателей интактных клеток.

Таким образом, можно констатировать, что криоконсервация спермы негативно отражается на оксидативно-антиоксидантном статусе, что может являться одним из патогенетических факторов нарушения репродуктивной функции быков.

Заключение. Процесс криоконсервации спермы быков голштинской породы, сопровождается изменением в цитоплазматической мембране сперматозоидов липид-белковых взаимодействий и метаболических характеристик спермиев, вызванных окислительным стрессом. Антиоксидантный потенциал супероксиддисмутазы после криоконсервации не зависел от инкубационного периода, активность каталазы после замораживания и оттаивания спермы не изменялась.

Об авторах

Марина Николаевна Иващенко

Нижегородский государственный агротехнологический университет им. Л.Я Флорентьева

Автор, ответственный за переписку.
Email: kafedra2577@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6642-8518

кандидат биологических наук, доцент

Россия, Нижний Новгород

Анна Вячеславовна Дерюгина

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: derugina69@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8812-8559

доктор биологических наук, доцент

Россия, Нижний Новгород

Андрей Александрович Белов

Нижегородский государственный агротехнологический университет им. Л.Я Флорентьева

Email: andrey.raven@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4869-5054

кандидат биологических наук, доцент

Россия, Нижний Новгород

Михаил Иванович Латушко

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: ancord.m@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0000-2997-0228

кандидат технических наук

Россия, Нижний Новгород

Анатолий Петрович Еремин

Нижегородский государственный агротехнологический университет им. Л.Я Флорентьева

Email: erapnn@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-0550-4876

кандидат ветеринарных наук, доцент

Россия, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы